黃瓜側(cè)枝抑制基因CLS的克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、分枝多少,長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱是黃瓜重要的農(nóng)藝性狀。對(duì)于培育腌漬品種和鮮食品種而言,兩者對(duì)側(cè)枝性狀的要求是不同的。一般來說對(duì)于培育腌漬品種來說,多數(shù)選用有限生長(zhǎng)型,一次采收。分枝的多少、長(zhǎng)勢(shì)的強(qiáng)弱就成了決定單株產(chǎn)量的最直接因素了。而對(duì)于培育鮮食品種來說,尤其是國(guó)內(nèi)黃瓜一般采用搭架栽培,要求在整個(gè)生長(zhǎng)季內(nèi)不斷采收,這就需要維持主莖旺盛的生命力,防止早衰。而側(cè)枝過多,勢(shì)必會(huì)削弱主莖的生長(zhǎng)勢(shì),還會(huì)造成空間密閉給病害發(fā)生創(chuàng)造了有利條件,而人工去除則費(fèi)時(shí)費(fèi)力

2、,所以國(guó)內(nèi)傾向于栽培少分枝或無分枝類型。了解清楚側(cè)枝的發(fā)育機(jī)理不僅有助于育種學(xué)家因地制宜的培育不同側(cè)枝類型的黃瓜品種,另一方面也能豐富分枝發(fā)育機(jī)制的基礎(chǔ)研究。但長(zhǎng)期以來,對(duì)黃瓜側(cè)枝的研究都限于對(duì)側(cè)枝性狀的遺傳學(xué)分析,一般認(rèn)為,多側(cè)枝性狀至少受到5個(gè)加性因子控制,且較容易受到環(huán)境和群體結(jié)構(gòu)的影響。但這些研究都止步于對(duì)側(cè)枝性狀的QTL定位,沒有鑒定控制側(cè)枝形成的關(guān)鍵基因,更未能對(duì)控制黃瓜分枝的分子機(jī)理進(jìn)行探究。這類型的研究無法對(duì)黃瓜分枝機(jī)理

3、做出深入地探討?；诖朔N因?yàn)?我們希望從本實(shí)驗(yàn)室收集的不同分枝類型的黃瓜品系入手,根據(jù)擬南芥等植物物研究側(cè)枝發(fā)育的方法對(duì)黃瓜分枝的機(jī)理做進(jìn)一步的研究。
　　 首先根據(jù)分枝多少將我們實(shí)驗(yàn)室收集的黃瓜育種資源分成三種不同的分枝類型:多側(cè)枝,S06是這一類中的代表,表現(xiàn)為在春秋兩季栽培時(shí)葉腋內(nèi)都會(huì)萌發(fā)大量的側(cè)枝,一般是每節(jié)都有一個(gè)側(cè)枝；少側(cè)枝,這一類的代表為S94,表現(xiàn)為側(cè)枝數(shù)量較少,每十節(jié)有不超過4個(gè)側(cè)枝,但是側(cè)枝較長(zhǎng)；無側(cè)枝類型,

4、這一類的代表是S61和S92,S61一般沒有側(cè)枝長(zhǎng)出,但是栽培后期溫度升高后在較低節(jié)位會(huì)有少于兩條的側(cè)枝萌發(fā)；而S92在葉腋處會(huì)形成側(cè)枝花打頂(側(cè)枝變成有限生長(zhǎng)型),多數(shù)節(jié)位的側(cè)枝在不到1CM就開始變成有限生長(zhǎng)型,但是較低節(jié)位會(huì)有一到兩個(gè)長(zhǎng)到8-10CM開始打頂。
　　 在對(duì)這些側(cè)枝的表型進(jìn)行初步分類的基礎(chǔ)上,我們參照了在擬南芥和豌豆上對(duì)側(cè)枝產(chǎn)生的分析途徑,進(jìn)行了嫁接試驗(yàn),以期通過這個(gè)研究長(zhǎng)距離信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將它們進(jìn)一步分類。結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)一部分多分枝品系的接穗被少側(cè)枝品系的砧木改變,說明這些黃瓜側(cè)枝后期發(fā)育受到一種嫁接轉(zhuǎn)移信號(hào)的調(diào)控,而多側(cè)枝的形成因?yàn)榍∏∈沁@種抑制信號(hào)缺失的結(jié)果。而在用無側(cè)枝S61做砧木的嫁接組合中,它不能改變多側(cè)枝接穗法表型,而S92則可以。該結(jié)果暗示S61無側(cè)枝的因?yàn)榭赡苁莻?cè)芽起始障礙,而S92無側(cè)枝的因?yàn)榭赡苌婕岸鄠€(gè)方面。為了能有更加有力的證據(jù),我們先后作了打頂試驗(yàn)和側(cè)芽的細(xì)胞學(xué)檢查,結(jié)果顯示:S06、S94和s92在頂端生長(zhǎng)受抑制時(shí),側(cè)芽

6、的生長(zhǎng)都有不同程度的促進(jìn)；而在頂端生長(zhǎng)抑制解除時(shí),S61的葉腋處依然沒有側(cè)枝長(zhǎng)出。細(xì)胞學(xué)檢查的結(jié)果也顯示在S06、S94和S92的葉腋處有側(cè)芽形成,而在S61的葉腋處只有花芽原基。以上的實(shí)驗(yàn)說明在多側(cè)枝的黃瓜品系中多側(cè)枝的因?yàn)槭且种菩盘?hào)的缺失；而無側(cè)枝S61的形成因?yàn)閯t是側(cè)芽原基起始障礙。進(jìn)一步通過對(duì)S92、S61和S06的遺傳分析,確定了S61的無側(cè)枝性狀受一個(gè)隱性單基因的控制,而S92的無側(cè)枝性狀顯然受到不止一個(gè)基因的控制。

7、　　 考慮到S61無側(cè)枝的表型與番茄、擬南芥、水稻等植物中的側(cè)枝抑制突變體(ls/las/mocl)的表型類似,可以推測(cè)在黃瓜中應(yīng)該存在它們的同源基因。我們根據(jù)番茄和擬南芥的LATERAL SUPPRESSOR基因的保守序列,利用RACE技術(shù)克隆了它們?cè)邳S瓜中的同源基因,CLS(EU503217),蛋白同源關(guān)系分析顯示屬于GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族,在進(jìn)化關(guān)系上與其它物種GRAS家族中的側(cè)枝抑制基因歸于同一個(gè)群。利用信號(hào)肽(NLS)預(yù)測(cè)軟件

8、對(duì)CLS蛋白序列進(jìn)行分析但是沒有發(fā)現(xiàn)核定位信號(hào)序列,于是構(gòu)建了CLS:GFP融合蛋白進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn),結(jié)果顯示CLS蛋白定位在細(xì)胞核里,推測(cè)作為轉(zhuǎn)錄因子行使功能。Southern分析顯示在黃瓜基因組中只有一個(gè)CLS基因的拷貝,在將CLS基因的cDNA序列轉(zhuǎn)化入擬南芥ls突變體后發(fā)現(xiàn),CLS基因的表達(dá)可以挽救擬南芥ls的突變體表型,這表明CLS是具有與LS/LAS相同功能的直系基因。半定量RT-PCR顯示CLS基因的表達(dá)部位與擬南芥,番茄

9、類似,為了更詳細(xì)的了解CLS基因的時(shí)空表達(dá),我們選擇不同分枝類型的品系,選取不同播種時(shí)期的頂芽FAA固定后作RNA原位雜交,結(jié)果顯示在有側(cè)枝的黃瓜植株中CLS的表達(dá)部位與擬南芥LAS的表達(dá)部位類似,轉(zhuǎn)錄本都集中在來源于頂端分生組織的側(cè)生分生組織區(qū)域,而且在新老分生組織的邊界區(qū)都能清楚地看見CLS基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)。說明它在黃瓜側(cè)芽起始過程中發(fā)揮了重要作用,是側(cè)生分生組織起始的標(biāo)志基因。值得注意的是,在無側(cè)枝的S61植株的側(cè)生分生組織區(qū)域卻檢

10、測(cè)不到CLS的轉(zhuǎn)錄信號(hào),說明S61無側(cè)枝的因?yàn)榕cCLS基因的表達(dá)缺陷有關(guān)。隨后,我們根據(jù)CLS基因在S61與S06序列上的差異設(shè)計(jì)得CAPS標(biāo)記,在S61與S06的分離群體中檢測(cè)該標(biāo)記的分離,也沒有發(fā)現(xiàn)它與無側(cè)枝性狀的共分離?？紤]到控制S61無側(cè)枝性狀的是一個(gè)隱性單基因,說明在黃瓜中存在另一個(gè)基因在上游調(diào)控著CLS基因的表達(dá),此基因的正常表達(dá)是CLS基因轉(zhuǎn)錄的前提。
　　 綜上所述,我們認(rèn)為黃瓜側(cè)枝的發(fā)育也可以分解為由不同基因調(diào)