B7-H4在腫瘤細胞內表達的生物學意義研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、B7-H4,又稱B7x和B7S1,是B7家族共刺激分子成員之一,并且能夠抑制T細胞的免疫功能。B7-H4分子 mRNA在人體外周組織中廣泛表達,而其蛋白在正常機體內則不表達或低表達,在眾多腫瘤細胞中則呈高表達。此外,研究發(fā)現 B7-H4的表達水平與疾病的惡化呈正相關。早期研究發(fā)現,B7-H4分子屬于I型跨膜糖蛋白,與淋巴細胞表面的相應受體結合,從而負性調控免疫反應。然而在一些腫瘤細胞中同樣發(fā)現了B7-H4在胞內的表達。臨床組織樣本的分析

2、結果顯示,膜表達B7-H4與腫瘤浸潤T淋巴細胞呈負相關,而胞內表達B7-H4分子與腫瘤浸潤T淋巴細胞無明顯相關性,由此可見,胞內B7-H4分子有區(qū)別于膜表達B7-H4分子的生物學功能。近期研究表明,B7-H4分子含有核定位序列,能夠穿梭于細胞核與細胞質之間;并且位于核內的B7-H4分子能夠促進細胞增殖、G1/S期的轉換。但是,對于B7-H4分子在腫瘤細胞內表達的生物學意義仍不十分清楚。本研究通過構建Flag標簽的B7-H4野生型(B7-

3、H4 WT)真核表達載體,瞬轉HEK293細胞,采用免疫共沉淀結合質譜的方法,尋找B7-H4分子在細胞內的相互作用蛋白;并通過基因芯片的方法分析構建的B7-H4野生型(B7-H4 WT)與核定位序列突變B7-H4(B7-H4 H250Q)的穩(wěn)轉細胞株,從而尋找B7-H4WT與B7-H4H250Q分子所引起的差異表達蛋白,更好地研究B7-H4在腫瘤細胞內表達的生物學意義。本研究分為兩個部分:
  第一部分:免疫共沉淀結合質譜法尋找B

4、7-H4分子相互作用蛋白及其生物學功能的初步研究。
  目的:尋找B7-H4分子相互作用蛋白,并對其生物學功能進行初步研究。
  方法:構建Flag標簽的 B7-H4野生型真核表達載體,通過 lipofectamine2000瞬轉HEK293,24-48h提取總蛋白,免疫共沉淀法獲得與B7-H4分子相互作用的蛋白,將相互作用蛋白跑WB并銀染,差異條帶膠回收,打質譜,分析數據,尋找相互作用蛋白,免疫共沉淀驗證相互作用蛋白;以及

5、通過構建 vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O以及vector/293、B7-H4 WT/293、B7-H4 H250Q/293穩(wěn)定轉染細胞株進行相應功能實驗。
  結果:構建了Flag標簽的 B7-H4野生型質粒,以及 vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O以及vector/293、B7-H4 WT/293、B7-H4 H2

6、50Q/293穩(wěn)定轉染細胞株;免疫共沉淀結合質譜找到了野生型B7-H4分子的相互作用蛋白,并且發(fā)現B7-H4分子對相互作用蛋白的活性有調控作用。
  結論:確定了B7-H4分子的互作蛋白DNA-PKcs,并初步證實B7-H4對該蛋白的活性有調控作用。
  第二部分:尋找B7-H4野生型(B7-H4 WT)及核定位序列突變型(B7-H4H250Q)在786-O細胞中的差異表達蛋白及其功能研究。
  目的:尋找B7-H4分

7、子引起的差異表達蛋白,并對其生物學功能進行研究。
  方法:通過基因芯片技術對上述構建的vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O穩(wěn)定轉染細胞株進行分析,尋找差異表達基因,Western blot實驗驗證差異表達蛋白,MTT細胞增殖實驗比較體外細胞增殖率的差異。
  結果:Western blot結果與基因芯片結果均發(fā)現一些與細胞侵襲及血管生成相關的差異表達蛋白,MTT增殖實驗

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