短小芽孢桿菌BS-4菌株對(duì)大豆疫病的生防作用及其機(jī)制研究.pdf

1、由大豆疫霉（Phytophthora sojae）引致的大豆疫病是一種嚴(yán)重威脅大豆生產(chǎn)的病害，每年給大豆生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。本文聚焦大豆疫病的生物防治，在對(duì)大豆疫霉拮抗細(xì)菌分離、鑒定、抑菌譜測(cè)定及發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究了短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）BS-4菌株及其代謝產(chǎn)物對(duì)大豆疫病的生防作用及其機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1大豆疫霉拮抗菌的分離、鑒定及生理生化特性研究
　　從安徽懷遠(yuǎn)大豆田塊土壤中分離

2、到1株對(duì)大豆疫霉具有強(qiáng)烈抑制作用的拮抗細(xì)菌BS-4。采用CTAB法提取BS-4菌株的總DNA，通過對(duì)其16S rDNA序列分析，進(jìn)行了分子鑒定，并測(cè)定了其菌落形態(tài)及生理生化特性。同時(shí)還研究了溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間和不同碳氮源對(duì)其生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，生防菌BS-4的16S rDNA序列片段大小為1416 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的短小芽孢桿菌Bacillus pumilus strain Y58（序列號(hào)：EF203211.1）

3、的同源性為89％；同時(shí)生理生化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果顯示，BS-4與短小芽孢桿菌的生理生化特征極其相似，據(jù)此將BS-4鑒定為短小芽孢桿菌（B. pumilus）。BS-4菌落初始呈圓形、淡黃色、半透明、表面光滑，培養(yǎng)后期其菌落顏色加深、透明度下降、表面凹凸不平出現(xiàn)褶皺、邊緣不規(guī)則；BS-4菌株的生長(zhǎng)受到溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間和不同碳、氮源的影響，其適宜生長(zhǎng)溫度為20～45℃，最適生長(zhǎng)溫度為37℃；同時(shí)它能在pH為7～9的范圍內(nèi)快速生長(zhǎng)，能夠適應(yīng)弱堿

4、性的環(huán)境，其生長(zhǎng)周期約為72 h。BS-4菌株能夠利用多種碳源和氮源，以在含有麥芽糖和NH4Cl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好。
　　2生防菌BS-4抑菌譜的測(cè)定
　　分別測(cè)定了生防菌BS-4菌株對(duì)15種病原真菌和8種疫霉菌的拮抗作用及其代謝液對(duì)不同病原菌的抑制作用。結(jié)果表明，BS-4菌株對(duì)不同病原菌的抑制作用具有差異性，其中BS-4菌株對(duì)核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、灰葡萄孢（Botrytis ciner

5、ea）具有強(qiáng)烈的抑制作用，抑制率均在70%以上；對(duì)稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）、燕麥鐮孢（Fusarium avenaceum）、黃色鐮孢（F. culmorum）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）和串珠鐮孢（F. moniliforme）具有中等抑制作用，抑制率在41.67～50.89%之間；對(duì)蘋果炭疽病菌（Co

6、lletotrichum gloeosporioides）、雪腐鐮孢（F. nivale）、尖孢鐮孢（F. oxysporum）和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）具有弱的拮抗作用，而對(duì)腐皮鐮孢（F. solani）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）幾乎沒有拮抗作用；BS-4菌株除了對(duì)辣椒疫霉（P. capsic）的拮抗作用較弱外，對(duì)其他疫霉菌均在50%以上。BS-4菌株的代謝液對(duì)不同病原菌的抑制作

7、用同樣存在差異，其中對(duì)核盤菌、灰葡萄孢、禾谷絲核菌（R. cerealis）、小麥全蝕病菌和立枯絲核菌抑制率為100%，對(duì)串珠鐮孢和黃色鐮孢的抑制率與對(duì)峙試驗(yàn)相比顯著下降；代謝液對(duì)疫霉菌具有明顯的抑制作用。
　　3生防菌BS-4發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　分別測(cè)定了碳、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)其發(fā)酵液生物活性的影響，采用正交試驗(yàn)法測(cè)定了其發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比；同時(shí)還測(cè)定了發(fā)酵溫度、pH、接菌量、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵條件對(duì)代謝液生物活性的影

8、響。結(jié)果表明，生防菌BS-4能利用果糖、木糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、乳糖作為碳源，其中麥芽糖作為碳源產(chǎn)生的發(fā)酵液對(duì)大豆疫霉的抑制作用最好，抑制率達(dá)到了70.03%；試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)， BS-4在NH4Cl條件下產(chǎn)生的代謝液對(duì)大豆疫霉具有良好的抑制作用，另外還發(fā)現(xiàn)， KH2PO4能顯著提高代謝液的抑菌活性。培養(yǎng)基配比正交試驗(yàn)表明，麥芽糖：NH4Cl：KH2PO4：胰蛋白胨比例為4：2：3：1時(shí)代謝液的抑制作用最明顯，對(duì)大豆疫霉菌

9、絲抑制率達(dá)到了71.42%，對(duì)不同配比的培養(yǎng)基進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C/N為4：3時(shí)產(chǎn)生的代謝液具有較高的抑制活性。發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果表明：BS-4在pH為7-9之間的培養(yǎng)基，接菌量為2%，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm，培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，發(fā)酵4-5 d其產(chǎn)生的代謝液生物活性最高。
　　4生防菌BS-4發(fā)酵液的理化性質(zhì)及對(duì)大豆疫霉的抑制作用
　　分別研究了生防菌BS-4發(fā)酵條件經(jīng)優(yōu)化后代謝的理化性質(zhì)及對(duì)大豆疫霉的抑制作用。結(jié)果顯示，發(fā)

10、酵液不同使用濃度對(duì)大豆疫霉的抑制作用存在差異，使用濃度與抑菌率之間存在線性關(guān)系；經(jīng)不同溫度處理后，對(duì)大豆疫霉仍具有生物活性，具有熱穩(wěn)定性；pH值影響了代謝液的生物活性，其最適pH值為8.0，代謝液能夠適應(yīng)pH7.0～9.0的弱堿性環(huán)境；不同生物酶處理過后，代謝液仍能保持活性，說明其產(chǎn)物可能是脂肽類化合物。代謝液對(duì)大豆疫霉菌絲的產(chǎn)量具有顯著的抑制作用，代謝液處理過后，菌絲鮮重和干重嚴(yán)重下降；同時(shí)還能抑制游動(dòng)孢子的萌發(fā)和芽管的伸長(zhǎng)以及卵孢子

11、的形成和大小。
　　5生防菌BS-4對(duì)大豆疫霉侵染及大豆植株體內(nèi)抗病酶系活性的影響
　　測(cè)定了生防菌BS-4及其代謝液對(duì)大豆疫霉侵染大豆葉片及植株的抑制作用，同時(shí)還研究了生防菌BS-4處理大豆植株后，大豆植株體內(nèi)與抗病性相關(guān)的PAL、POD和PPO的活性變化。結(jié)果顯示，大豆疫霉的游動(dòng)孢子和菌絲體在生防菌處理的葉片上的侵染受到明顯影響，游動(dòng)孢子在BS-4菌液前處理和后處理的葉片上均不能侵染，菌絲在前處理的葉片上不能侵染而在后處

12、理的葉片上能輕微侵染。生防菌處理大豆植株后進(jìn)行挑戰(zhàn)接種大豆疫霉，結(jié)果顯示，經(jīng)生防菌BS-4處理后，大豆疫霉在接種部位僅能輕微發(fā)病，病斑不能擴(kuò)展，植株生長(zhǎng)良好，而對(duì)照組大豆嚴(yán)重發(fā)病，接種6d后植株死亡。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，生防菌處理后再挑戰(zhàn)接種大豆疫霉，植株體內(nèi)的PAL、POD和PPO三個(gè)與抗性相關(guān)的酶類活性發(fā)生變化，接種3d后三種酶的活性均達(dá)到頂峰，隨后開始下降，到接種6 d時(shí)又有所上升，但幅度不大；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，生防菌BS-4單獨(dú)處理過后，植株

13、體內(nèi)的PAL和POD活性能夠顯著上升，并能持續(xù)到第4d，而PPO的活性升高不明顯。這些結(jié)果說明生防菌BS-4誘導(dǎo)植物抗性是防治大豆疫霉的機(jī)理之一。
　　6生防菌BS-4在大豆植株的定植及對(duì)根圍微生物的影響
　　測(cè)定了生防菌BS-4在大豆葉片及根際周圍的定殖及對(duì)土壤微生物種群的影響。結(jié)果表明：生防菌BS-4能夠在大豆葉片上定植，但持效期較短，僅能維持11d；接種7d后，在葉片上分離到的菌落數(shù)僅為8.0×105cfu/g，接種1

14、1 d后幾乎檢測(cè)不到生防菌BS-4的存在；但是生防菌BS-4在土壤中具有良好的生存能力，接種1 d后菌落數(shù)目出現(xiàn)一個(gè)高峰，之后逐漸降低當(dāng)接種5d后，其菌落數(shù)目達(dá)到穩(wěn)定，之后菌落數(shù)目穩(wěn)定在107數(shù)量級(jí)，上下略有浮動(dòng)，但變化不大。同時(shí)生防菌BS-4接種后，對(duì)土壤中的真菌和細(xì)菌有一定的影響，真菌數(shù)目在接種初期有所下降，接種10 d后又有所回升；細(xì)菌數(shù)目在接種初期急劇上升，但在接種后期又趨于穩(wěn)定；生防菌BS-4對(duì)放線菌的影響不大，其菌落數(shù)目未出