粘連分子Paraxial Protocadherin在非洲爪蟾耳基板發(fā)育中的功能研究.pdf

1、脊椎動(dòng)物的內(nèi)耳是聽(tīng)覺(jué)的主要功能性器官。在內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中，最早出現(xiàn)的形態(tài)上可見(jiàn)的結(jié)構(gòu)是位于胚胎兩側(cè)預(yù)定后腦和預(yù)定表皮旁的一個(gè)增厚的外胚層細(xì)胞區(qū)域，即耳基板。耳基板隨后內(nèi)陷形成一個(gè)耳杯，然后它從胚胎表皮脫落形成一個(gè)囊泡狀結(jié)構(gòu)稱(chēng)為聽(tīng)泡。聽(tīng)泡細(xì)胞經(jīng)歷了一段強(qiáng)烈的增殖和復(fù)雜的細(xì)胞分化及形態(tài)發(fā)生時(shí)期，最終分化形成內(nèi)耳的各種細(xì)胞。在各種脊椎動(dòng)物中，已經(jīng)證明多種信號(hào)分子和多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等都與內(nèi)耳的特化和圖式建成有關(guān)。但是，還有許多發(fā)育的具體機(jī)制目前還

2、不是很清楚。 本論文報(bào)道了一個(gè)粘連分子cadherin家族的成員ParaxialProtocadherin(PAPC)對(duì)于非洲爪蟾聽(tīng)泡的形成是必需的。原位雜交結(jié)果表明，在肉眼可見(jiàn)的耳基板出現(xiàn)以前，PAPC已經(jīng)特異性地在耳基板的前體細(xì)胞中表達(dá)。在隨后的內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中PAPC持續(xù)特異性地表達(dá)在耳杯，聽(tīng)泡等內(nèi)耳細(xì)胞中。PAPC的這種表達(dá)圖式強(qiáng)烈提示PAPC可能參與爪蟾內(nèi)耳的早期發(fā)育過(guò)程。同時(shí)，利用顯性失活質(zhì)粒DN-PAPC或M-PA

3、PC競(jìng)爭(zhēng)性地抑制PAPC的功能可導(dǎo)致聽(tīng)泡結(jié)構(gòu)的缺失和早期內(nèi)耳特異性標(biāo)志基因Sox9和Tbx2的表達(dá)缺失，而且這一表型能夠被FL-PAPC共注射所拯救回復(fù)正常。這些結(jié)果都提示PAPC分子對(duì)于爪蟾胚胎早期的聽(tīng)泡的形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞特化是必需的。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)PAPC異位注射并不足以誘導(dǎo)一個(gè)新的異源的耳基板的形成。 為了進(jìn)一步研究PAPC的蛋白水平的表達(dá)及其生物學(xué)功能，需要制備PAPC的抗體，但至今沒(méi)有商業(yè)化的PAPC抗體，其他文獻(xiàn)也未

4、見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此我們應(yīng)用GST表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)融合蛋白PAPC-GST。然后用常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔，獲得PAPC多克隆抗體。Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，以1：3000稀釋的該多克隆抗體為一抗時(shí)，可以在轉(zhuǎn)染了全長(zhǎng)PAPC(FL-PAPC)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞的蛋白抽提物中雜交出特異的印跡條帶，PAPC蛋白可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制該抗體對(duì)FL-PAPC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白抽提物的特異性條帶。用1：500稀釋的該抗體為一抗進(jìn)行免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)P