色象中藥調(diào)節(jié)小鼠B16黑素瘤細胞酪氨酸酶活性的實驗研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 色素代謝障礙性疾病(如白癜風、黃褐斑等),發(fā)病率高,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。隨著生活水平的提高,人們更加重視這類疾病的防治。近年來,國內(nèi)開展中醫(yī)藥與色素代謝關系的研究已經(jīng)成為熱點,許多中藥對酪氨酸酶活性、黑素細胞代謝的影響已經(jīng)有了初步的揭示,研究的方法技術亦日益成熟。但是,目前大多數(shù)研究都局限于觀察單味中藥或復方中藥的研究上,鮮有從中藥色象理論的角度設計較為系統(tǒng)的多層次的研究,有關色象中藥對黑素代謝影響與

2、干預機理的研究尚為缺乏。中醫(yī)在長期醫(yī)療實踐中積累了“以白治黑,以黑治白”的臨床經(jīng)驗,導師楊柳教授通過長期的臨床探索與理論研究,在取象比類思維啟示下創(chuàng)立了治療色素性皮膚病的中藥色象理論,形成了具有鮮明特色的理論和治療方法。認為中藥顏色與色素性皮膚病的療效有一定的相關性,并首次將這種表明藥材顏色與療效相關的現(xiàn)象稱之為“中藥色象”,將這種治療色素病色效相關的中藥,稱之為“色象中藥”。初步研究中藥藥材顏色與色素性皮膚病的療效之間的關系,并取得了

3、一定的成果。
　　 另外,白蒺藜作為臨床上治療色素代謝障礙性疾病常用藥物,既治療色素增加病,又治療色素減退病。近年來有關白蒺藜對酪氨酸酶活性的實驗研究有不少報道,但實驗結(jié)果報道差異較大,甚至相反。我們以往的初步研究結(jié)果表明白蒺藜具有雙向調(diào)節(jié)黑素細胞增殖和酪氨酸酶活性的作用,但其雙向調(diào)節(jié)的內(nèi)在機制尚未十分清楚。因此,對色象中藥調(diào)節(jié)黑素瘤細胞代謝及白蒺藜雙向調(diào)節(jié)黑素代謝這兩方面的研究,是非常有必要的,這對于中醫(yī)藥理論發(fā)展、中藥開發(fā)研

4、究、色素病理論的創(chuàng)新以及臨床實踐的指導都具有較好的應用前景與實際意義。
　　 基于此,本研究通過查閱大量的文獻資料及臨床資料,并結(jié)合臨床實踐經(jīng)驗,篩選出中醫(yī)傳統(tǒng)治驗及現(xiàn)代研究表明治療色素病有效的使用頻率高的黑白兩類中藥各10種,以目前研究技術較為成熟的酪氨酸酶、細胞增殖及黑素合成作為觀察指標,研究色象中藥對體外培養(yǎng)的黑素瘤細胞中酪氨酸酶活性的影響,以及采用中藥血清學的方法研究白蒺藜雙向調(diào)節(jié)色素代謝的作用機制,探討色象中藥與色素代

5、謝的相關性,為色象理論及臨床辨證用藥提供科學依據(jù),同時為中醫(yī)藥治療色素病的研究提供新的思路,并對中醫(yī)藥治療色素病的理論進行新的梳理,進而能夠有效地指導臨床。
　　 方法與內(nèi)容：
　　 1、通過查閱大量的文獻資料及臨床資料,并結(jié)合臨床實踐經(jīng)驗,篩選出中醫(yī)傳統(tǒng)治驗及現(xiàn)代研究表明治療色素病有效的使用頻率高的中藥,依據(jù)飲片的外在顏色分為黑(深色)、白(淺色)兩組,每組各選10味藥作為代表藥,制備各單味中藥水提液,并用不含胎牛血清

6、的培養(yǎng)基進行稀釋,使藥物終質(zhì)量濃度為20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml。
　　 2、參照醫(yī)學實驗動物學及中藥血清學的方法,制備不同給藥劑量白蒺藜含藥血清,并用不含胎牛血清的培養(yǎng)基進行稀釋,使三種給藥劑量含藥血清藥物終質(zhì)量濃度均為20μg/ml,并以此濃度進行研究。
　　 3、應用細胞培養(yǎng)學技術,將黑素瘤細胞株進行體外培養(yǎng)。采用多巴速率氧化法測定黑白兩組不同濃度中藥水提取液、不同給藥劑量白蒺藜含藥血清對細胞中酪氨

7、酸酶活性的影響；采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定不同給藥劑量白蒺藜含藥血清對細胞增殖的影響；采用NaOH裂解法測定不同給藥劑量白蒺藜含藥血清對細胞中黑素合成含量的影響。每種藥物每個濃度設3個復孔,重復3次,并設對照組。
　　 3、應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,每一實驗均重復3次,數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,采用單因素方差分析的Dunnett檢驗比較黑白兩組中藥不同濃度實驗組與空白對照組之間的差異性；動物血清實驗采用LSD—t檢驗進

8、行統(tǒng)計學分析,以P<0.05時表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、中藥調(diào)節(jié)酪氨酸酶活性測定結(jié)果:與空白對照組相比較,黑色組藥物中,雞血藤、丹參、菟絲子、補骨脂在低、中、高濃度(5、10、20μg/ml)、制首烏、紅花、女貞子在中、高濃度(10、20μg/ml)、熟地、益母草在高濃度(20μg/ml)、墨旱蓮在低濃度(5μg/ml)對酪氨酸酶活性有明顯促進作用(f<0.05或P<0.01,差異具有統(tǒng)計學意義)

9、。白色組中,白芨、山藥在高濃度(20μg/ml)、茯苓、白芍在中、高濃度(10、20μg/ml)、白蒺藜、白芷、當歸在低、中濃度(5、10μg/ml)對酪氨酸酶活性有明顯抑制作用(P<0.05,差異具有統(tǒng)計學意義)。而白芷、白蒺藜、當歸在高濃度(20μg/ml)、桃仁在中、高濃度(10、20μg/ml)、白茯苓、自芍在低濃度(5μg/ml)對酪氨酸酶活性則有促進作用。白術、薏苡仁與空白對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

10、>　　 2、白蒺藜含藥血清對細胞增殖的影響結(jié)果:低劑量組與空白組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),有明顯抑制細胞增殖作用；高劑量組、陽性對照組與空白對照組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),有明顯促進細胞增殖作用(P<0.01或P<0.05)；中劑量組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。低劑量組與陽性對照組相比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),具有明顯抑制細胞增殖的作用；高劑量組、中劑量組與陽性對照組比

11、較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 3、白蒺藜含藥血清對黑素合成的影響結(jié)果:低劑量組與空白對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),有明顯抑制細胞增殖作用；高劑量組、陽性對照組與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05),有明顯促進細胞增殖作用；中劑量組與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。低劑量組與陽性對照組相比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),具有明顯抑制細胞增殖作用；

12、高劑量組、中劑量組與陽性對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　 全文結(jié)論：
　　 1、黑(深)色組10味中藥對細胞中酪氨酸酶活性均有促進作用,并呈現(xiàn)隨濃度的增高而增強的趨勢；白(淺)色組10味中藥中有7種中藥對細胞中酪氨酸酶活性具有抑制作用,呈現(xiàn)隨濃度的增高而增強的趨勢。說明黑(深)色組中藥對酪氨酸酶活性的促進作用更明顯,而白(淺)色組中藥對酪氨酸酶活性的抑制作用更明顯。
　　 2、白蒺藜、白芷、白

13、茯苓、白芍、熟地黃五味中藥對細胞中酪氨酸酶活性具有雙向調(diào)節(jié)作用。如白蒺藜、白芷呈現(xiàn)為低濃度抑制高濃度促進；白茯苓、白芍、熟地黃則呈現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制。
　　 3、桃仁雖為白色但對細胞中酪氨酸酶活性起到促進作用。
　　 4、白色組中藥中,白術、薏苡仁對細胞中酪氨酸酶活性不具有促進或抑制作用。
　　 5、白蒺藜含藥血清對細胞增殖、黑素合成含量的影響與大鼠給藥劑量有關,并呈現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用,即低、中劑量含藥血清(