木鱉子醇提物抑制小鼠黑素瘤B16細胞增殖及其機制的實驗研究.pdf

1、目的:研究木鱉子提取物對腫瘤細胞生長的影響,探討其抗腫瘤機制;觀察木鱉子醇提物(CMSEE)對黑素瘤B16細胞的分化作用,并探討其對MAPKs相關(guān)蛋白的影響;分析木鱉子醇提物CMSEE對小鼠黑素瘤細胞B16及其荷瘤小鼠移植瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響,初步探討其作用機制,為其作為抗腫瘤新藥開發(fā)提供參考依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、制備木鱉子提取物:木鱉子醇提物(CMSEE)和水提物(CMSWE);采用四甲基偶氮唑藍法(MTT)法檢

2、測CMSWE和CMSEE對乳腺癌細胞株MDA-MB-231,小鼠黑色素瘤細胞株B16,食管癌細胞株ECa109,人紅白血病細胞株K562,肺癌細胞株A549和正常細胞生長的影響,計算細胞生長抑制率,并在光鏡下觀察細胞形態(tài)變化。
　　 2、采用克隆集落形成實驗檢測不同濃度CMSEE(40,20,10μg/ml)作用于B16細胞6d后,對細胞克隆形成的影響。
　　 3、采用流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢

3、測不同濃度CMSEE(0,40,100μg/ml)作用24h后,B16細胞周期分布和凋亡率的變化。
　　 4、采用MTT方法檢測不同濃度CMSEE(10,20,40,100μg/mL)作用于B16細胞24,48,72h后增殖抑制情況,比色法檢測CMSEE對B16細胞黑素生成和酪氨酸酶活性的影響,并采用Giemsa染色技術(shù)和電子顯微鏡觀察其形態(tài)變化及黑色素小體的形成情況。
　　 5、采用免疫印跡技術(shù)(western blo

4、t)檢測MAPKs相關(guān)蛋白(t-ERK1/2,p-ERK1/2,t-JNK,p-JNK,t-P38,p-P38)在CMSEE誘導(dǎo)B16細胞分化過程中的作用。
　　 6、通過劃痕實驗和體外遷移實驗檢測不同質(zhì)量濃度CMSEE(20,25,30μg/mL)作用24和48h后,B16細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的改變。
　　 7、分別用RT-PCR和Western印跡法檢測不同質(zhì)量濃度CMSEE(20,25,30μg/mL)作用24h,以

5、及25μg/mL CMSEE作用不同時間(0,6,12,24,36,48h)對B16細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9 mRNA及其蛋白表達和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(tissueinhibitor of metalloproteinase,TIMP)-1、TIMP-2蛋白表達的影響。8以B16細胞建立小鼠荷瘤模型,用10mg/kg CMSEE灌胃治療荷瘤小鼠,HE染色觀察各

6、組小鼠的腫瘤、肝、脾組織的病理變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、木鱉子醇提物(CMSEE)(25-300μg/mL)對B16,A549,ECa109,MDA-MB-231,K562細胞的增殖具有明顯的抑制作用(P＜0.01),并呈劑量依賴性,對正常細胞的生長沒有明顯影響。CMSWE(25-300μg/mL)對MDA-MB-231,ECa109,A549和K562細胞的增殖沒有明顯的影響(p＞O.05),僅對B16細胞的生長

7、有抑制作用,且抑制效果顯著低于CMSEE(p＞0.01)。
　　 2、CMSEE(10,20,40μg/mL)對B16細胞增殖有較強的抑制作用,隨著CMSEE作用濃度的增加,克隆數(shù)及克隆大小逐漸變小。與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜O.05)。
　　 3、經(jīng)不同濃度CMSEE(0,40,100μg/ml)處理24h后,40μg/ml CMSEE未出現(xiàn)明顯的凋亡峰,而100μg/ml CMSEE出現(xiàn)了明顯的凋亡峰。細胞周期檢

8、測結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的增大,處于G0/G1期的細胞增多,G2/M期的細胞減少。(p＜0.05)。
　　 4、CMSEE對B16細胞增殖有較強的抑制作用,隨著CMSEE濃度及作用時間的增加,對細胞的抑制率升高。其中100μg/mLCMSEE作用72h對細胞抑制率最高達70.06％,與對照組相比,不同濃度CMSEE對細胞增殖的抑制率均有顯著性差異(P＜0.05)。CMSEE作用B16細胞后,細胞表現(xiàn)出典型的分化狀態(tài),黑素產(chǎn)生和酪

9、氨酸酶活性增加(P＜0.01),細胞呈平行排列,并出現(xiàn)樹突狀突起,微結(jié)構(gòu)黑色素小體多見。
　　 5、Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)CMSEE處理后B16細胞中出現(xiàn)P38MAPK的持續(xù)磷酸化,伴隨著ERK1/2和JNK的脫磷酸化。ERK1/2和JNK特異性的抑制劑增強了CMSEE誘導(dǎo)的B16細胞的分化,而P38MAPK的抑制劑阻礙了CMSEE誘導(dǎo)的B16細胞的分化。結(jié)果表明,MAPKs活性的變化與CMSEE誘導(dǎo)的黑素瘤B16

10、細胞分化有關(guān)。
　　 6、CMSEE(20-30μg/mL)可明顯抑制B16細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,可使B16細胞劃痕的直徑明顯變寬(P＜0.05),穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)顯著減少(P＜0.05),并呈濃度依賴性。
　　 7、CMSEE(20～30μg/mL)可明顯下調(diào)B16細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達(p＜0.05),并有濃度依賴性;而CMSEE對B16細胞中TIMP-1和TIMP-2蛋

11、白表達無明顯影響(P＞0.05)。
　　 8、CMSEE可有效抑制小鼠體內(nèi)黑素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論:
　　 1、木鱉子提取物(水提物和醇提物)體外均具有抗腫瘤作用,但是木鱉子醇提物較水提物抗腫瘤的作用更強,尤其對黑素瘤B16細胞抑制作用最明顯。
　　 2、CMSEE能誘導(dǎo)B16細胞分化,且作用機制可能與其調(diào)節(jié)MAPKs通路相關(guān)蛋白激酶(P38,ERK1/2,JNK)活性有關(guān)。
　　 3、C