兩株缺失SORF3-TK基因重組鴨腸炎病毒的構(gòu)建及其基本生物學(xué)特性研究.pdf

1、鴨病毒性腸炎(duck viral enteritis，DVE)，又名鴨瘟(duck plague，DP)，是鴨、鵝及多種雁形目禽類(lèi)的一種急性、熱性、敗血性傳染病，曾相繼在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本病病原為鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)，亦稱(chēng)鴨皰疹病毒1型(Anatid herpesvirus1),在2011年第九次病毒分類(lèi)報(bào)告(ICTV)中，將其劃分為皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科馬

2、立克病毒屬。
　　 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆DEV C-KCE株US區(qū)序列和TK序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增同源臂基因，將左右同源臂基因克隆至pEASY-blunt simple和pMD18-T simple載體，構(gòu)建pEASY-S3和pMD18T-TK載體。將表達(dá)盒插入pEASY-S3、pMD18-T-TK兩同源臂構(gòu)建缺失病毒轉(zhuǎn)移載體pEASY-S3-gpt-EGFP、pMD18-T-TK-gpt。將重組載體與DEV感染細(xì)胞的總DNA共轉(zhuǎn)染次代

3、鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)，利用霉酚酸(MPA)加壓，8代篩選、富集和純化，得到重組病毒，經(jīng)PCR、IIF鑒定正確，命名為DEV-AS3、DEV-ATK。
　　 分別提取雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞和DEF細(xì)胞上不同代重組病毒DEV-△S3、DEV-△TK基因組分別擴(kuò)增鑒定基因皆得到陽(yáng)性結(jié)果，證明缺失重組病毒穩(wěn)定存在。將100 TCID50 DEV和DEV-△S3以及DEV-△TK分別接種于CEF細(xì)胞，在不同時(shí)間分別收集接毒后細(xì)胞上清

4、、接毒后細(xì)胞和上清以及接毒后用胰酶消化的細(xì)胞，測(cè)定病毒效價(jià)，繪制病毒生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果表明SORF3基因和TK基因可能與DEV病毒的侵入有關(guān)。親本病毒與重組病毒的蝕斑大小無(wú)顯著差異，表明SORF3和TK基因的缺失并沒(méi)有影響病毒的毒力。
　　 測(cè)定親本病毒與重組病毒效價(jià)，以5000 TCID50/只將重組病毒及親本病毒免疫4周齡SPF鴨，每組隔離培養(yǎng)，設(shè)立同居組、親本病毒組及疫苗組對(duì)照。每周采集鴨血收集血清，利用間接ELISA方法檢測(cè)

5、血清中抗體IgG的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，重組病毒和親本病毒免疫組比疫苗免疫組產(chǎn)生抗體的時(shí)間稍晚，但抗體持續(xù)時(shí)間比疫苗免疫組要長(zhǎng)，重組病毒免疫組的抗體水平略低于親本病毒免疫，差異不顯著，同居組的抗體水平略有上升仍為陰性;同時(shí)也對(duì)各組免疫鴨的咽及泄殖腔棉拭子進(jìn)行了DEV的基因檢測(cè)，沒(méi)有擴(kuò)出相應(yīng)的目的片段，說(shuō)明重組病毒和親本病毒免疫并不能引起免疫鴨的排毒。中和抗體試驗(yàn)的結(jié)果顯示重組病毒組與親本病毒具有相似的免疫原性。免疫后第九周分別取親本病毒組