重癥急性胰腺炎SIRS大鼠中性粒細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)變化及大黃素的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景和目的:
　　 重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是一種發(fā)病急、進展快、并發(fā)癥多、病死率高的臨床嚴(yán)重疾病。全身炎性反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)是SAP發(fā)展至多器官功能障礙綜合征（multipleorgansdysfunctionsyndrome，MODS）的前期表現(xiàn)，是其高病死率的主要原因。過度的炎性反應(yīng)可導(dǎo)致機體免疫功

2、能下降，器官感染、功能受損等，進而導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生率明顯升高[1,2]，進一步加重SAP病情的發(fā)展，形成惡性循環(huán)。因此，阻斷SIRS向MODS的進展是降低SAP高病死率的關(guān)鍵。多形核中性粒細(xì)胞（polymorphonuclearneutrophils，PMN），是炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著關(guān)鍵的作用[3]。PMN凋亡障礙或延遲是SIRS的主要病理生理過程。鈣離子作為人體內(nèi)最普遍的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子之一，調(diào)節(jié)著許多細(xì)胞

3、和組織的生理活動，其穩(wěn)態(tài)失衡是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。
　　 本實驗旨在SAP所致的SIRS大鼠模型中，研究PMN細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)鈣離子濃度變化，并進一步探討大黃素(Emodin)和地塞米松（Dexamethasone）對其的影響及作用機制，以確定鈣穩(wěn)態(tài)是否為大黃素和地塞米松的治療靶點，為其臨床治療SAP提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 采用經(jīng)十二指腸乳頭逆行膽胰管注射1.5％脫氧膽酸鈉溶液的方法制備重癥急性胰

4、腺炎SIRS大鼠模型。
　　 第一階段:分組及模型制備:將健康SD大鼠隨機分組，即A組（假手術(shù)組）、B組（重癥急性胰腺炎SIRS模型對照組）、C組（Emodin干預(yù)組:C1組干預(yù)終濃度為1ug/ml;C2組干預(yù)終濃度為5ug/ml;C3組干預(yù)終濃度為10ug/ml），每組10只;體外干預(yù)實驗:造模24小時后，采取外周血分離中性粒細(xì)胞，然后根據(jù)實驗要求分別進行藥物干預(yù)，A組（生理鹽水）、B組（生理鹽水）、C1（Emodin干預(yù)終濃

5、度為1ug/ml）、C2（Emodin干預(yù)終濃度為5ug/ml）、C3(Emodin干預(yù)終濃度為10ug/ml)。收集藥物干預(yù)24小時后的PMN，檢測各組的PMN凋亡率。
　　 第二階段:分組及模型制備:將健康SD大鼠隨機分為5組，即假手術(shù)組(SO組)，重癥急性胰腺炎SIRS模型對照組（MCO組）、地塞米松干預(yù)組（DEX組）、Emodin干預(yù)組（EMD組，干預(yù)終濃度5ug/ml，由第一階段結(jié)果確定）、Emodin聯(lián)合地塞米松干預(yù)

6、組（EAD組），每組20只（后四組統(tǒng)稱為重癥胰腺炎SIRS模型組---SAP.SIRS組）。體外干預(yù)實驗:造模24小時后，將SO組外周血分離的PMN分為2份，即假手術(shù)對照組（SOC組）和假手術(shù)鈣拮抗組（SOCA組），然后根據(jù)實驗要求分別進行藥物干預(yù)，SOC組（生理鹽水）、SOCA組（拉西地平干預(yù)終濃度1μg/L，乙醇終濃度＜0.2％）、MCO組（生理鹽水）、DEX組（干預(yù)終濃度為0.1umol/ml）、EMD組（干預(yù)終濃度為5ug/ml

7、，乙醇終濃度＜0.1％）、EAD組。收集藥物干預(yù)24小時后的PMN，檢測各組PMN凋亡率及細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)鈣離子濃度變化。
　　 結(jié)果:
　　 第一階段:各組PMN凋亡百分率檢測結(jié)果顯示，A組PMN凋亡百分率明顯高于B組(P＜0.01);C1組、C2組PMN凋亡百分率均高于B組(P＜0.01)，其中C2組PMN凋亡百分率明顯高于C1組(P＜0.05);C3組PMN基本處于晚期凋亡或繼發(fā)壞死象限。
　　 第二階段:

8、
　　 1、應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組PMN凋亡百分率
　　 (1)SO組:SOCA組細(xì)胞凋亡百分率明顯低于SOC組(P＜0.01)。
　　 (2)SAP.SIRS組:DEX組、EMD組、EAD組細(xì)胞凋亡百分率均高于MCO組(P＜0.05)，其中DEX組升高程度最小;EMD組、EAD組細(xì)胞凋亡百分率均高于DEX組(P＜0.05):EMD組與EAD組兩組相比較沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　 (3)SO

9、組與SAESIRS組:MCO組細(xì)胞凋亡百分率明顯低于SOC組(P＜0.01);EMD組、EAD組細(xì)胞凋亡百分率均高于SOC組(P＜0.05);DEX組細(xì)胞凋亡百分率低于SOC組（P＜0.05）。
　　 2、應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測PMN胞內(nèi)鈣離子濃度變化
　　 (1)SO組:SOCA組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯低于SOC組(P＜0.01)。
　　 (2)SAESIRS組:DEX組、EMD組、EAD組三組細(xì)胞內(nèi)鈣離子

10、濃度較MCO組均有不同程度的升高(P＜0.05)，其中DEX組升高程度最小;EMD組、EAD組兩組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均高于DEX組(P＜0.05);EMD組與EAD組兩組相比較沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　 (3)SO組與SAP.SIRS組:MCO組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯低于SOC組(P＜0.01);EMD組、EAD組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均高于SOC組(P＜0.05);DEX組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度低于SOC組(P＜0.05)。

11、>　　 3、應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測PMN線粒體內(nèi)鈣離子濃度變化
　　 (1)SO組:SOCA組線粒體內(nèi)鈣離子濃度明顯低于SOC組（P＜0.01）。
　　 (2)SAP.SIRS組:DEX組、EMD組、EAD組三組線粒體內(nèi)鈣離子濃度較MCO組均有不同程度的升高(P＜0.05)，其中DEX組升高程度最小;EMD組、EAD組兩組線粒體內(nèi)鈣離子濃度均高于DEX組（P＜0.05）;EMD組與EAD組兩組相比較沒有顯著性差異

12、（P＞0.05）。
　　 (3)SO組與SAP.SIRS組:MCO組線粒體內(nèi)鈣離子濃度明顯低于SOC組(P＜0.01);EMD組、EAD組線粒體內(nèi)鈣離子濃度均高于SOC組(P＜0.05);DEX組線粒體內(nèi)鈣離子濃度低于SOC組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 重癥急性胰腺炎SIRS大鼠模型的PMN凋亡率明顯低于正常大鼠，可能與PMN鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān);Emodin能通過增加PMN胞內(nèi)及線粒體內(nèi)鈣離子濃度，促進重