哺乳動物細胞高效表達載體的優(yōu)化.pdf

1、哺乳動物細胞由于有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等可用于進行蛋白質(zhì)糖基化的結(jié)構(gòu)和機制以及具有與人十分相似的糖基化方式，它表達的蛋白質(zhì)往往具有天然蛋白的構(gòu)象及生物學(xué)特性，這是大腸桿菌、酵母及昆蟲表達所無法比擬的優(yōu)點。但是，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)也面臨外源基因在哺乳動物細胞中表達水平低、獲得高表達細胞株的時間長等問題。解決這些問題的至關(guān)重要的一步是哺乳動物細胞表達載體的構(gòu)建及其進一步優(yōu)化，因此本研究以CHO-dhfr-細胞為宿主細胞，從目的基因表達單元的優(yōu)

2、化和篩選基因的弱化兩個方面對構(gòu)建的哺乳動物細胞表達載體進行優(yōu)化。 本研究以pMCEd-k2tPA載體為基礎(chǔ)對目的基因表達單元中的表達調(diào)控元件進行優(yōu)化研究，使用的表達調(diào)控元件有：hCMV和hEF-1α啟動子、hCMVEnhancer、hEF-1α1stintron以及翻譯增強子H213和V163。k2tPA是tPA的一種突變體，可以通過溶圈法測定它的表達水平，遂以k2tPA為報告基因構(gòu)建了8個含有不同表達調(diào)控元件組合的定點整合型

3、表達載體。然后在定點整合型表達系統(tǒng)中比較不同載體轉(zhuǎn)染CHO-dhfr--Z+細胞形成克隆的k2tPA表達水平，進而比較這些不同表達調(diào)控元件的表達效率并篩選到了兩種表達效率有明顯提高的表達調(diào)控元件組合：hCMV啟動子與H213以及hEF-1α啟動子與V163組合的表達效率分別是僅含hCMV啟動子的156.6％和139.5％。 同時，本研究中以Neo基因為篩選基因，采用多種方式對其進行弱化，具體的弱化方式有：在Neo基因的起始密碼

4、子前添加不同閱讀框架的ATG/改變其Kozak序列、將Neo基因置于內(nèi)含子中以及使用活性降低的突變體?；谏鲜霾煌娜趸绞綐?gòu)建了6個隨機整合型載體(e、f、g、h、t和u)，通過隨機整合的方法，以這些載體轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞后的克隆形成率以及克隆的k2tPA混合表達水平為指標(biāo)，比較了不同弱化方式的篩選效率。所構(gòu)建的載體都明顯低于通用的商業(yè)化哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1(+)的克隆形成率，其中e、f的克隆形成率分別為：11

5、5Colonies/2.0×105Cells和62Colonies/2.0×105Cells；初步評價了g、h、t和u的篩選效率，g和h在轉(zhuǎn)染2.0×106Cells時沒形成克隆，t的克隆形成率(10Colonies/2.0×106Cells)比u的要低一個數(shù)量級。 本研究在目的基因表達單元的優(yōu)化和篩選基因Neo基因的弱化方面都獲得了較理想的結(jié)果，為進一步研究不同表達調(diào)控元件間的相互作用、實現(xiàn)外源基因在哺乳動物細胞中的高效表達