短蛸（Octopus ocellatus）酚氧化酶的分離純化及其部分生物化學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、酚氧化酶(ECl.10.3.1)能夠催化單酚羥化成二酚(如多巴)，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。酚氧化酶(phenoloxidase，PO)廣泛存在于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中。在無脊椎動(dòng)物中(節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物)，PO主要參與宿主的非特異性免疫防御反應(yīng)；其中在頭足類動(dòng)物中則主要參與墨汁黑色素和表皮細(xì)胞色素的形成。在脊椎動(dòng)物中PO主要參與皮膚色素的形成。由于PO在無脊椎動(dòng)物中的重要作用，對(duì)PO的研究主要集中于無

2、脊椎動(dòng)物。但到目前為止，還沒有軟體動(dòng)物八腕目動(dòng)物PO的研究報(bào)道。 短蛸(Octopus ocellatus)屬于軟體動(dòng)物門頭足綱八腕目蛸科(章魚科)，短蛸又名八帶或短腳蛸，廣泛分布在渤海、黃海、東海、南海和日本列島等海域，是備受人類喜愛的美味動(dòng)物。對(duì)短蛸酚氧化酶的分離純化和性質(zhì)研究，不僅對(duì)于認(rèn)識(shí)酚氧化酶在墨汁黑色素形成過程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制具有重要的意義，而且還有助于我們查清其在進(jìn)化中的地位。 為了揭示短蛸酚氧化酶

3、的生物化學(xué)性質(zhì)，本文以短蛸墨汁為材料，利用Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析和DEAE Sepharose。Fast Flow離子交換柱層析等方法，對(duì)短蛸PO進(jìn)行了分離純化和部分生物化學(xué)性質(zhì)研究。PO分離純化和生物化學(xué)性質(zhì)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短蛸PO分子量可能為153.8 kDa，含有為75.6 kDa和73.0 kDa兩個(gè)亞基。以L-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)為特異性底物對(duì)PO活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其最適pH值為7.0左右，最適溫度

4、為40℃左右；對(duì)底物．L-DOPA的Km值約為3.1 mmol／L，對(duì)底物兒茶酚(catechol)的K<,m>值約為6.3 mmol／L；綜合該P(yáng)O能氧化L-DOPA和兒茶酚(臨苯二酚)、而不能氧化對(duì)苯二酚和酪氨酸(單酚)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明該酶極可能是一種兒茶酚酶(catechol oxidase)類型的酚氧化酶。利用多種氧化酶抑制劑對(duì)PO純化樣品的酶活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，苯硫脲(phenyl thiourea)和亞硫酸鈉(sodium s

5、ulfite)對(duì)PO活性具有很強(qiáng)的抑制作用；抗壞血酸(ascorbic acid)、硫脲(thio urea)和檸檬酸(citric acid)、苯甲酸(benzoic acid)對(duì)PO活性也具有較強(qiáng)的抑制作用，而PO對(duì)半胱氨酸(cysteine)不敏感，兒茶酚酶的特異性抑制劑苯硫脲能強(qiáng)烈抑制短蛸PO的活性，表明該酶確為兒茶酚酶。該酶對(duì)EDTA，DETC和金屬離子非常敏感，其活性能被Cu<'2+>，EDTA和DETC強(qiáng)烈抑制，Mg<'2