載鼠疫亞單位疫苗的多孔微球.pdf

1、鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌引起的人獸共患烈性傳染病，歷史上已經(jīng)有數(shù)以?xún)|計(jì)的人被鼠疫奪走了生命。免疫接種是預(yù)防鼠疫的重要措施之一，但目前的鼠疫疫苗都存在各自的問(wèn)題：滅活疫苗生產(chǎn)安全性差，保護(hù)效率低，有效期短，副反應(yīng)率高，對(duì)肺鼠疫保護(hù)效果不佳：減毒鼠疫活菌苗，皮下注射對(duì)腺鼠疫保護(hù)效果好，但不良反應(yīng)較大，有潛在毒性，對(duì)肺鼠疫不能完全保護(hù)，免疫效果不確定；重組亞單位疫苗能夠克服傳統(tǒng)疫苗的許多缺陷，不含有感染性組分，無(wú)致病性，而且對(duì)腺鼠疫和肺鼠疫均具

2、有一定的免疫保護(hù)作用，但目前單純亞單位疫苗免疫效果仍不理想。由可生物降解材料制成的微球是疫苗的良好載體，同時(shí)也是一種佐劑，但通常在微球制備過(guò)程中，疫苗要經(jīng)受高機(jī)械剪切力和有機(jī)溶劑的考驗(yàn)，容易失去活性，因此在獲得疫苗微球的過(guò)程中如何保持疫苗活性便成了關(guān)鍵問(wèn)題。本文旨在研究一種可以避免傳統(tǒng)微球缺陷并保留其優(yōu)勢(shì)的以多孔微球?yàn)檩d體并具有佐劑效應(yīng)的鼠疫亞單位疫苗新型給藥系統(tǒng)，提高其肌肉注射和鼻黏膜給藥后的免疫效果。
　　 首先以生物可降解

3、材料聚乳酸一羥基乙酸共聚物( PLGA)為載體，分別以氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉為致孔劑，采用乳化溶劑揮發(fā)法來(lái)制備多孔微球，以光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡考察了微球形態(tài)學(xué)特征和粒徑大小。結(jié)果表明，三種致孔劑中，碳酸鈉的致孔效果最好，碳酸氫鈉次之，氯化鈉最差。其次，選擇碳酸氫鈉和碳酸鈉作為致孔劑，設(shè)計(jì)單因素多水平實(shí)驗(yàn)考察了多種處方和工藝因素對(duì)所制得多孔微球孔隙率的影響，結(jié)果表明：隨著內(nèi)水相中致孔劑濃度的上升，微球孔隙率增大；固化過(guò)程中加入鹽酸的量越

4、多，孔隙率越低：隨著加入鹽酸時(shí)間的推移，微球孔隙率增高；不同處方和工藝因素對(duì)碳酸氫鈉和碳酸鈉作為致孔劑所制得多孔微球的影響相似，但以碳酸鈉作為致孔劑所制得的多孔微球均勻性更好，孔隙率更大。在此基礎(chǔ)上，確定以碳酸鈉作致孔劑，以牛血清白蛋白(BSA)為模型藥物，采用Lts(37)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察了影響微球粒徑、包封率和載藥量的處方工藝因素。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，微球粒徑分布較均勻，孔隙率較高，但吸附載藥量較低。其中顯著影響微球粒徑的處方工藝因素

5、為：內(nèi)水相中致孔劑的濃度和固化過(guò)程中加入鹽酸的量。致孔劑濃度增大，微球粒徑增大；固化過(guò)程中加入鹽酸的量增加，微球粒徑減小。顯著影響微球孔隙率和吸附載藥量的因素為內(nèi)水相中致孔劑的濃度、固化過(guò)程中加入鹽酸的量以及加入鹽酸的時(shí)間：致孔劑濃度增大，微球孔隙率和吸附載藥量都上升；固化過(guò)程中加入鹽酸的量增加，微球孔隙率和載藥量下降：加入鹽酸時(shí)間越靠后，微球孔隙率和載藥量上升。
　　 為了驗(yàn)證多孔微球載疫苗后免疫的效果，以鼠疫F1抗原和V抗原

6、疫苗為目標(biāo)藥物，采用上述優(yōu)化處方工藝條件所制得的多孔微球，通過(guò)孵育法將鼠疫亞單位疫苗吸附于多孔微球之上，制成鼠疫亞單位疫苗的多孔微球給藥系統(tǒng)。鼠疫F1抗原和V抗原疫苗微球的載藥量分別是115 ug/mg和74 ug/mg。以雌性BALB/c小鼠為動(dòng)物模型，以載鼠疫疫苗多孔微球組為實(shí)驗(yàn)組，以單純抗原組和單純微球組為對(duì)照組，采用肌肉注射給藥方式考察了不同實(shí)驗(yàn)組的免疫保護(hù)效果：通過(guò)ELISA法測(cè)定小鼠抗體滴度，通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)考察小鼠存活率。結(jié)果

7、顯示：采用肌注方式給藥，載鼠疫F1抗原的多孔微球和載鼠疫V抗原的多孔微球均顯示了良好的免疫保護(hù)效果，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的抗體滴度均比單純抗原或單純微球的對(duì)照組相應(yīng)的抗體滴度顯著要高(P<0.05)，攻毒實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠的存活率也顯著高于單純抗原或單純微球的對(duì)照組(P<0.01)。最后我們進(jìn)行了載鼠疫亞單位疫苗多孔微球的鼻黏膜給藥免疫學(xué)評(píng)價(jià)，考察鼻黏膜給藥與肌肉注射給藥對(duì)鼠疫疫苗免疫學(xué)效果的影響，設(shè)計(jì)了不同的給藥途徑和給藥劑量組。初步結(jié)果顯示，目前

8、所制鼠疫疫苗多孔微球鼻黏膜免疫效果相對(duì)于肌肉注射的免疫效果要差。這可能因?yàn)槲⑶蛟谛∈蟊乔磺宄俾蔬^(guò)快，從而導(dǎo)致疫苗尚未達(dá)到起效時(shí)間便被清除，因而不能引起足夠的免疫應(yīng)答。
　　 綜上所述，本文以生物可降解材料PLGA為載體，采用乳化溶劑揮發(fā)法，通過(guò)在內(nèi)水相中加入碳酸鈉為致孔劑，制備獲得了多孔微球，該多孔微球孵育后可以吸附鼠疫F1抗原和V抗原的亞單位疫苗，經(jīng)注射給藥獲得了比單純抗原或單純微球更好的免疫保護(hù)效果。上述結(jié)果提示，本研究所