蛋白同化類固醇激素對青春期發(fā)育個體GnRHa處理后生長的影響.pdf

1、中樞性性早熟(centralprecociouspuberty，CPP)是下丘腦-垂體-性腺軸提前發(fā)動，性腺發(fā)育，分泌性激素，使患兒骨生長板過早性激素暴露(接觸)，骨成熟加速-骨齡提前，使青春期生長時間縮短而對成年身高帶來負面影響，成年身高不能達到遺傳靶身高(targetHeight，THt)。改善成年身高是CPP治療的y要目標之一，理想的藥物應能促進長骨生長/成熟的正平衡。促性腺激素釋放激素擬似物(gonadotropinreleas

2、inghormorleagonist，GnRHa)是近年用于改善中樞性性早熟患兒成年終身高的豐要藥物，它因能有效抑制性腺發(fā)育，性激素分泌減少而延緩骨齡增長，但治療過程中可致牛長減速，減速嚴重者可而成為影響療效的癥結。目前主要應用基因重組生長激素(recombinantgrowthhormone，rhGH)克服減速，但其價格極其昂貴。蛋白同化類固醇激素(anabolic-androgenicsteroids，AS)能促進長骨線性生長，但應

3、用不當時可使骨成熟加速，對終身高呈負面影響，其機制未明。本研究以GnRHa處理的青春期個體為對象，以注射了GnRHa的青春期大鼠生長板的軟骨細胞進行離體和在體動物實驗，以及CPP患兒的臨床研究，探討蛋白同化類固醇激素對青春期發(fā)育個體GnRHa處理后對生長的影響及其機制，為尋求生長激素以外克服GnRHa治療中生長減速有效、安全而且經(jīng)濟的另一臨床治療選擇奠定理論基礎。 第一部分蛋白同化類固醇激素對GnRHa處理后青春期大鼠生長板軟骨

4、細胞增殖和分化的影響及機制探討 (一)目的: (1)探索高效合理的大鼠長骨生長板軟骨細胞分離方法和體外培養(yǎng)條件，建立一種理想的軟骨細胞體外培養(yǎng)體系。對分離培養(yǎng)的軟骨細胞的形態(tài)和生長特性進行觀察，為進一步實驗提供條件。 (2)應用AS制劑司坦唑醇(stanozolol，ST)研究其對離體培養(yǎng)的GnRHa處理后青春期大鼠生長板軟骨細胞的增殖、成熟和分化的影響。探索ST促進生長/成熟正平衡的量、時效關系。 (3

5、)離體研究司坦唑醇對GnRHa處理后青春期大鼠與促進生長有密切關系的生長板軟骨細胞胰島素樣生長因子-1(IGF-1)mRNA表達和IGF-1合成分泌的影響。 (4)離體實驗探索司坦唑醇經(jīng)由雌激素受體α(ERα)、雄激素受體(AR)、IGF-1受體(IGF-1R)介導軟骨細胞增殖/分化的途徑，以及兩種受體與生長因子受體后信號通路的交互影響(cross-talk)，以探討ST促進骨生長/成熟生物效應的分子層面的可能機制。 (

6、5)通過分子動力學模擬方法預測司坦唑醇與ERα的相互作用方式，探討ERα與司坦唑醇和雌二醇相互作用方式的同異。 (二)材料和方法:1.軟骨細胞的分離與培養(yǎng)鑒定雌鼠3周齡末時斷乳并開始肌注GnRHa制劑曲普瑞林，每2周一次，共2次，7周末時處死，無菌取出脛骨生長板。采用二次酶消化法獲得軟骨細胞，觀察軟骨細胞生長特性，行軟骨細胞鑒定并繪制生長曲線，選擇處于對數(shù)生長期的原代細胞用于實驗研究。 2.司坦唑醇對體外培養(yǎng)GnRHa處

7、理后青春期大鼠生長板軟骨細胞增殖和成熟分化的影響將原代軟骨細胞接種于96孔板和24孔板，常規(guī)培養(yǎng)48小時后進行細胞饑餓24小時，之后時效組(0、1、2、3、4、5天)中ST組培養(yǎng)基內(nèi)加入司坦唑醇(終濃度10-8M)分別培養(yǎng)，量效組于培養(yǎng)液中加入不同濃度的ST(0、10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M)作用48小時，通過MTT法和免疫組化法檢測軟骨細胞核增殖細胞核抗原(PCNA)、胞漿中I

8、I型膠原(軟骨細胞增殖指標)、X型膠原(軟骨細胞分化成熟指標)的表達，了解司坦唑醇對軟骨細胞增殖的影響和時效、量效的關系。 3.司坦唑醇對GnRHa處理后青春期大鼠生長板軟骨細胞IGF-1mRNA表達及其蛋白合成分泌的影響按3×105個細胞/皿的密度將原代軟骨細胞懸液接種于35mm的培養(yǎng)皿，于接種72小時后首次更換培養(yǎng)基，之后每2天更換1次至70～80％融合，再用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，次日進行ST干預。按時效組和量效組不同時

9、間行ST劑量處理，IGF-1mRNA表達時效組ST濃度均為10-7M，于0、2～16小時共6個時間點，量效組(0、10-11IM～10-5M，8個濃度點)作用時間8小時，完成處理后收取各組的細胞進行熒光實時定量RT-PCR檢測IGF-1mRNA。 IGF-1蛋白合成分泌時效組ST濃度均為10-7M，于0、5～40小時共6個時間點，量效組(0、10-11M～10-5M，8個濃度點)作用時間20小時，完成處理后取細胞上清液濃縮后以E

10、LISA法測定IGF-1，并對貼壁細胞進行計數(shù)。 4.IGF-1R、ERα和AR-受體后信號及其間交聯(lián)作用對ST促進軟骨細胞增殖分化機制的研究將原代軟骨細胞接種于96孔培養(yǎng)板及24孔板，分別用4個阻斷劑，AR阻斷劑(BIC)、ER阻斷劑(ICI182.780)、IGF-1受體(IGF-1R)阻斷劑(AG1024)、絲裂原激活蛋白激酶激酶(MAPKK)阻斷劑(PD98059)。每個阻斷劑設置三個濃度。常規(guī)培養(yǎng)72小時后換成0.02

11、％無激素胎牛血清的培養(yǎng)液進行細胞饑餓，饑餓24小時后預先在ST+阻斷劑組、單純阻斷劑組中加入各阻斷劑后再在單純ST組、ST+阻斷劑組再加入ST(司坦唑醇最終濃度為10-8M)，無藥對照組則繼續(xù)用0.02％胎牛血清培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)72小時后取出進行MTT比色及PCNA免疫組化。 5.分子動力學模擬方法對司坦唑醇與雌激素受體α相互作用方式的研究依據(jù)已知的雌激素受體蛋白ERα的三維晶體結構，通過基于AMBER立場的分子動力學模擬方法來

12、預測雌激素受體α與司坦唑醇的相互作用方式，使用MM-PBSA方法模擬計算雌激素受體α和司坦唑醇的結合自由能，并從動力學的角度探索并解釋了雌激素受體蛋白ERα與小分子相互作用和識別機制。 第二部分蛋白同化類固醇激素對GnRHa處理后青春期大鼠生長影響的實驗研究 (一)目的:經(jīng)在體動物研究，觀察GnRHa處理后的青春期大鼠ST對軟骨生長板的生長和成熟的影響，探索ST促進長骨生長和成熟平衡的量、時效關系。 (二)材料

13、和方法:正常清潔級SD雌鼠3周齡末時斷乳，量效組按隨即區(qū)組(同窩)設計(每窩7只)分為7組(6只/組)，分別為5000ug/100g、200ug/100g、100ug/100g、50ug/100g、25ug/100g、溶劑對照組、空白對照組。時效組按隨即區(qū)組(同窩)設計(每窩8只)分為8組(6只/組)分別為：2天組、3天組、5天組、7天組、10天組、13天組、溶劑對照組、空白對照組。并開始肌注GnRHa，每2周一次，共2次，在第二次注射

14、GnRHa3天(D1)后開始干預處理：(1)量效組于D1～D13分別每日注射相應劑量的ST。(2)時效組按療程長短分別于D1～D13(13天組)、D1～D10(10天組)、D1～D7(7天組)、D1～5(5天組)、D1～3(3天組)、D1～2(2天組)接受劑量為100ug/100gST注射處理。溶劑對照組于D1～D13只接受等量注射大豆油，空白對照組不進行任何處理。所有大鼠于D14處死。比較接受不同處理的大鼠體重增長、鼻肛長度增長、脛骨

15、長度、脛骨生長板HE染色進行生長板的寬度、增殖區(qū)的寬度、肥大區(qū)寬度、增殖區(qū)軟骨細胞數(shù)、肥大區(qū)軟骨細胞數(shù)的分析、PCNA免疫組化半定量分析及血清IGF-1濃度檢測。 第三部分(臨床部分) (一)目的:臨床研究(1)探討不完全性CPP(又稱單純性乳房早發(fā)育)向完全性CPP轉化的相關風險因素。 (2)前瞻分析CPP患兒在GnRHa治療中出現(xiàn)生長減速時司坦唑醇對克服減速的療效。 (二)材料和方法:1對象和方法

16、縱向回顧分析中山大學附屬第一醫(yī)院1995-2005近十年確診為PT的151例患兒的臨床及實驗診斷資料中與轉化相關的因素。 2對象和方法分析在我院確診特發(fā)性CPP并接受了曲普瑞林(達菲林)治療的女性患兒30例，分3組，①單獨GnRHa組②GnRHa+ST組③GnRHa+GH組。GnRHa+ST組為前瞻性研究，單獨GnRHa組和GnRHa+GH為回顧配對組，配對原則是在曲普瑞林治療過程中均出現(xiàn)生長減速(GV<4cm/年)，且骨齡達1

17、0.5～14歲。達菲林50～100μg/kg，每隔28天一次。ST30μg/kg/d，連續(xù)服用三個月后停三個月；GH采用金磊賽增(長春金賽藥業(yè)有限責任公司)，劑量1U/kg.w，分6～7次，睡前皮下注射；單獨達菲林治療組在出現(xiàn)減速后繼續(xù)應用達菲林，不加任何藥物。觀察時間為從研究開始共6個月。比較各組研究前后乳房大小及陰毛發(fā)育情況、生長速度的改變、骨齡進展情況、按骨齡判斷的身高標準差分值(HtSDSba)、預測成年身高(PAH)、按遺傳靶