以HBc顆粒為載體甲型流感通用疫苗的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 流感病毒(Influenza virus)是一種能夠引起嚴重性呼吸道傳播疾病的正粘科屬病毒。根據(jù)其內部核蛋白(NP)和基質蛋白(M)的抗原性不同，可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三種類型。其中，甲型流感病毒曾引起多次大范圍的流行，上世紀共出現(xiàn)四次大流行，最為嚴重的是1918年的大流感，造成了全世界5千多萬人死亡。2009年世界范圍內暴發(fā)的豬源性甲型流感病毒流行，傳染性強，波及范圍廣，再次突顯了甲型流感病毒感染

2、的嚴重性及其對人類社會造成的巨大經(jīng)濟負擔。
　　 接種疫苗是預防流感發(fā)生與傳播的最有效方式。目前市場應用的流感疫苗主要有三種：全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗。這些疫苗對同亞型流感病毒感染預防有效，但在不同亞型病毒之間的保護效果較弱。此外，流感病毒的變異速度非?？欤鞲幸呙缑磕甓家鼡Q，給疫苗的生產制備造成了諸多不便。世界衛(wèi)生組織是依據(jù)當年全世界范圍流感病毒變化情況來預測并推薦下一年流感疫苗生產用組分的，預測的準確度將會直接

3、影響疫苗的保護效率，如預測失敗將造成流感爆發(fā)流行的潛在威脅。因此，研制出一種具有廣泛保護作用的通用型疫苗對于應對流感病毒突變后的突然爆發(fā)，迅速建立人群免疫屏障，阻斷流感大流行蔓延，降低其危害性方面具有極其重要的實際意義。
　　 甲型流感通用疫苗的研發(fā)主要基于流感病毒基質蛋白胞外功能區(qū)M2e(Ectodomainof matrix protein2)，其在各種甲型流感病毒中具有極高的保守性，且可誘導特異性保護抗體產生。此外還有高度

4、保守的流感病毒核蛋白NP(Nucleoprotein)，其表面具有多個細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別表位，可誘導細胞免疫。但M2e和NP表位的分子量小、免疫原性低、易降解，在體內難以產生足夠的免疫反應。所以，使用結構復雜病毒蛋白作為免疫原性放大載體成為表位疫苗研發(fā)的熱點。其中，乙肝病毒核心蛋白HBc(Hepatitis B virus core protein，HBc)蛋白具有天然的顆粒組裝能力，能特異性激發(fā)針對外源表位的體液、細胞免

5、疫。近年來，HBc顆粒的應用方面已經(jīng)有了較成熟研究結果。疫苗研究中以HBc作為載體的疫苗抗原有很多，如乙肝病毒表面抗原、人乳頭瘤病毒E7蛋白、B群鏈球菌CPS糖蛋白等，在臨床前實驗研究中已觀察到肯定的療效。因此，發(fā)展以HBc顆粒為載體的流感病毒表位疫苗研究具有很好的前景和應用價值。
　　 目的：
　　 本研究的目的是構建以乙肝病毒核心蛋白(HBc)為載體的基于M2e蛋白的甲型流感通用疫苗抗原，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)及大腸桿

6、菌表達系統(tǒng)表達、純化和鑒定，并進行疫苗免疫效果初步評價，為發(fā)展安全、有效、具有廣泛保護作用的甲型流感通用疫苗奠定基礎。
　　 方法與結果：
　　 第一部分 sf9昆蟲細胞表達甲型流感M2e通用疫苗抗原的構建、表達、純化及鑒定
　　 通過基因工程方法，構建含M2e重復片段的3M2e-HBc-pFastBacHTA重組質粒。將該重組質粒與DH10Bac中的穿梭載體Bacmid同源重組，獲得3M2e-HBc-Bacmi

7、d重組桿粒。提取桿粒DNA轉染sf9昆蟲細胞，得到含有重組桿狀病毒。繼續(xù)擴增病毒，感染細胞后，免疫熒光檢測成功表達出3M2e-HBc目的蛋白。Western blot檢測該蛋白具有免疫活性。利用pFastBacHTA載體上帶有的組氨酸標簽，進行親和層析，純化獲得3M2e-HBc重組蛋白。電鏡結果顯示，3M2e-HBc目的基因可以通過桿狀病毒sf9昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達并正確裝配出病毒樣顆粒。
　　 第二部分大腸桿菌表達甲型流感M2

8、e-NP通用疫苗抗原的構建、表達、純化及鑒定
　　 通過基因工程方法，構建并鑒定獲得3M2e-NP-HBc-pET21a重組表達質粒，并轉化大腸桿菌細胞，IPTG誘導表達首先獲得了包涵體形式表達的重組蛋白。經(jīng)變性及復性純化處理后，包涵體蛋白形成的重組病毒顆粒的狀態(tài)不理想。經(jīng)進一步優(yōu)化誘導表達條件獲得了部分可溶性表達的重組蛋白，Western blot檢測證明該蛋白具有免疫活性。采用層析方法獲得純化的3M2e-NP-HBc重組蛋白

9、。電鏡觀察結果顯示，大腸桿菌表達的可溶性重組蛋白能夠自動裝配成大小約為30nm的病毒樣顆粒。
　　 第三部分甲型流感通用疫苗免疫效果初步評價
　　 通過動物免疫實驗，初步評價甲型流感通用疫苗的免疫應答效果及交叉保護作用。采用間接ELISA法、流式細胞術、ELISOPT技術，對疫苗在Balb/C小鼠體內的免疫應答效果進行了評估。在對大腸桿菌表達的流感通用疫苗評價的結果中顯示，疫苗以滴鼻和腹腔注射兩種途徑免疫小鼠，均可以誘導

10、產生針對不同亞型流感病毒的特異性體液及細胞免疫應答，并且滴鼻免疫能夠激發(fā)更高的黏膜局部免疫應答，說明采用滴鼻免疫這種更接近于流感病毒自然感染途徑的方式免疫對提高流感疫苗的保護效果具有重要意義。同時，攻毒試驗結果顯示，以A/Beijing/501和A/PR/8/34兩株代表性的甲型流感病毒攻毒后，疫苗免疫組相比對照組明顯降低小鼠的死亡率，表明大腸桿菌表達的以HBc為載體的甲型流感通用疫苗具有良好的免疫原性交叉保護作用。
　　 結論