以乙型肝炎病毒核心蛋白為載體的新型疫苗研究.pdf

1、本研究旨在利用HBc自身所具有的一系列優(yōu)點(diǎn)，包括具有高度的免疫原性，是一種T細(xì)胞依賴性和T細(xì)胞非依賴性抗原，沒有遺傳限制；能形成顆粒樣結(jié)構(gòu)，允許外源插入，可以將上述性質(zhì)傳遞給與之融合的外源序列，并且將這些外源序列以重復(fù)且高密度的方式展示在自身表面；可以允許對(duì)自身進(jìn)行替換、添加、缺失等修飾；能在E.coli中進(jìn)行大量的表達(dá)，并能快速制備等，借助以激發(fā)體液免疫為主的炭疽表位和以激發(fā)細(xì)胞免疫為主的結(jié)核抗原為模型，構(gòu)建以HBc為疫苗載體的新型炭

2、疽表位疫苗和新型結(jié)核亞單位疫苗，探討HBe作為疫苗載體輔助增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的機(jī)制，構(gòu)建體液免疫和細(xì)胞免疫通用的新型疫苗及新發(fā)突發(fā)傳染病病原體快速反應(yīng)的載體，以更好地適應(yīng)現(xiàn)代疫苗，尤其是軍用生物防御疫苗的需求。
　　 本研究中首先利用重疊延伸PCR的方法，通過4輪PCR拼接，1輪PCR擴(kuò)增，得到了編碼乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)氨基端144個(gè)氨基酸的核酸序列HBc-N144?；谒玫降臏y(cè)序正確的質(zhì)粒pET21a-HB

3、c-N144，在HBc-N144疫苗載體主要的免疫顯性區(qū)域(MIR區(qū))的78-79位氨基酸之間插入了本室前期鑒定得到的炭疽保護(hù)性抗原PA結(jié)構(gòu)域2中的282-283100p序列，這段序列被認(rèn)為與介導(dǎo)炭疽致死因子(LF)和水腫因子(EF)進(jìn)入胞質(zhì)，PA與受體結(jié)合，穩(wěn)定PA七聚體的穩(wěn)定性等生物學(xué)作用相關(guān)，而且被認(rèn)為包含一個(gè)炭疽保護(hù)性抗原主要的中和性表位“SFFD”，得到了嵌合的HBc/炭疽表位疫苗HBc-N144-PA-loop2。研究中借助

4、Western blotting技術(shù)驗(yàn)證了抗體與這種嵌合蛋白的結(jié)合，通過透射電子顯微鏡技術(shù)檢測(cè)了這種嵌合蛋白裝配成顆粒的情況。負(fù)染和透射電子顯微鏡的結(jié)果表明，攜帶有炭疽表位的HBC/炭疽表位嵌合蛋白可以形成電子顯微鏡下可見的直徑約為30nm的顆粒樣結(jié)構(gòu)，這與HBC分子天然狀態(tài)下形成的顆粒結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)上沒有明顯差異。此后，在動(dòng)物模型上驗(yàn)證了這種HBc/炭疽表位疫苗HBc-N144-PA-loop2的免疫學(xué)性質(zhì)。免疫小鼠模型上的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)

5、果表明HBc-N144-PA-loop2能激發(fā)針對(duì)炭疽保護(hù)性抗原(PA)的特異性抗體。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所獲得的HBc/炭疽表位疫苗的免疫學(xué)性質(zhì)，在相對(duì)小鼠更為理想的評(píng)價(jià)模型，豚鼠模型上檢測(cè)了特異性抗體的消長情況，發(fā)現(xiàn)HBc/炭疽表位疫苗HBc-N144-PA-Ioop2不僅可以激發(fā)抗PA抗體（實(shí)質(zhì)上為PA表位特異性抗體），也能激發(fā)針對(duì)炭疽毒素的中和性抗體，并且在40LDso劑量的炭疽芽胞攻毒實(shí)驗(yàn)中，部分保護(hù)免疫的豚鼠對(duì)抗炭疽芽胞的侵襲。而

6、之前本室用含有此中和性表位“SFFD”的特異性噬菌體克隆作為抗原免疫小鼠，僅觀察到了抗PA抗體的產(chǎn)生，未觀察到明顯的毒素中和活性。此外，在豚鼠試驗(yàn)中也觀察到了HBc一定的佐劑效應(yīng)，HBc-N144-PA-loop2不加佐劑組和使用氫氧化鋁佐劑組可以激發(fā)幾乎一樣高的抗PA抗體（即表位特異性抗體）和中和性抗體，并且能保護(hù)57％的免疫豚鼠對(duì)抗炭疽芽胞的侵襲。相對(duì)于重組PA(rPA)激發(fā)的免疫效果而言，HBe-N144-PA-loop2組在抗P

7、A抗體、中和性抗體、保護(hù)率等方面均略低，考慮到PA是83kDa的大分子，包含多個(gè)表位，而HBc-N144-PA-loop2僅含有其中的一個(gè)表位，用HBc作為炭疽表位疫苗的載體是可行的，但HBc-N144-pA-loop2激發(fā)免疫反應(yīng)的能力還需優(yōu)化。
　　 為提高HBe-N144-PA-loop2作為炭疽表位疫苗的效力，本研究以序列正確的pET21 a-HBc-N144-PA-loop2為基礎(chǔ)，通過反向PCR技術(shù)對(duì)HBc載體進(jìn)行了

8、MIR區(qū)79-81位氨基酸的缺失突變和添加天然HBe羧基端145-149位氨基酸的延長突變，得到了HBc分子MIR區(qū)的缺失突變體H144DL2和羧基端延長突變體H149L2，并去掉了HBc-N144-PA-loop2包含的多余氨基酸和組氨酸標(biāo)簽，得到H144L2；通過檢測(cè)改造后的HBe/炭疽表位疫苗激發(fā)體液免疫的各項(xiàng)指標(biāo)的變化，評(píng)價(jià)了HBc的改造效果。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)突變的嵌合蛋白仍可以形成電鏡下可見的顆粒狀結(jié)構(gòu)；HBc分子MIR區(qū)的缺失突變

9、(H144DL2)可以使抗PA抗體有所增加，抗HBc抗體較HBe-N144組顯著下降，并顯著低于HI44L2組激發(fā)的抗HBe抗體；此外HBc分子MIR區(qū)的缺失突變體H144DL2還顯著激發(fā)了僅次于rPA組的中和性抗體，并且組內(nèi)所有動(dòng)物的免疫血清都能被檢測(cè)到中和性抗體，各動(dòng)物體間中和性抗體的滴度值分布也相對(duì)集中，并且能100%保護(hù)免疫的小鼠對(duì)抗炭疽致死毒素的攻擊。HBc羧基端的延長突變體H149L2未能增加抗PA抗體，抗體效價(jià)低于H144

10、L2的水平：抗HBe抗體的滴度稍有增加；相對(duì)HBc-N144組和空白對(duì)照組可顯著激發(fā)中和性抗體，組內(nèi)動(dòng)物免疫血清中也均被檢測(cè)到了中和性抗體，但抗體滴度低于H144DL2組；小鼠的死亡時(shí)間廷長。佐劑效應(yīng)的研究結(jié)果表明，H144L2不加佐劑組相對(duì)使用鋁佐劑和弗氏佐劑組激發(fā)了最高的抗PA抗體，能保護(hù)50%的小鼠，小鼠的死亡時(shí)間由攻毒后6h延長到了10h，這提示，H144DL2不加佐劑可能是一個(gè)較好的HBc/炭疽表位疫苗劑型。此外，本部分還優(yōu)化

11、了重組蛋白的表達(dá)純化工藝，排除了內(nèi)毒素的干擾。
　　 本研究還在HBe中插入結(jié)核抗原ESAT-6，初步探討了HBe輔助增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。以本室構(gòu)建的攜帶有ESAT-6的質(zhì)粒PAS22-ESAT-6和pET21 a-H144L2為模板，借助HBc分子核酸序列中的Msc I酶切位點(diǎn)，將全長288bp的ESAT-6基因序列通過平端連接引入到HBc的78-79位氨基酸之間，得到以HBc為疫苗載體的新型結(jié)核亞單位疫苗HE6。通

12、過WB檢測(cè)了重組蛋白HE6與抗體的結(jié)合，通過負(fù)染和透射電鏡技術(shù)驗(yàn)證了顆粒的形成。由于機(jī)體抗結(jié)核桿菌的感染主要以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，所以能否有效地激發(fā)機(jī)體的T細(xì)胞免疫，尤其是CD4+Thl型細(xì)胞的免疫反應(yīng)是評(píng)價(jià)結(jié)核疫苗效力的關(guān)鍵。本研究在小鼠模型上評(píng)價(jià)了HE6的免疫學(xué)性質(zhì)。通過對(duì)小鼠的特異性免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的HBc/結(jié)核亞單位疫苗HE6使用和不使用佐劑組均可激發(fā)高效價(jià)的ESAT-6特異的IgG2a和IgG1，而且抗體的滴

13、度水平均顯著高于單獨(dú)使用rESAT-6加鋁佐劑免疫組。rESAT-6加鋁佐劑免疫組激發(fā)的IgG2a效價(jià)最低，僅約為2.81xi02，這提示單獨(dú)使用rESAT-6加鋁佐劑免疫組不能很好地激發(fā)Thl型反應(yīng)。雖然HE6使用和不使用鋁佐劑組激發(fā)的IgG2a的抗體滴度均超過1o3，但I(xiàn)gG2a/IgG1比值無顯著性差異。HE6使用和不使用鋁佐劑組的ELISPOT結(jié)果顯著高于空白組和ESAT-6單獨(dú)加鋁佐劑免疫組，表明HBc的使用顯著增加了分泌IF

14、N-r的T細(xì)胞數(shù)目，提示HBc的使用能有助于增強(qiáng)Thl型反應(yīng)。流式的結(jié)果表明，HE6不加佐劑組中rESAT-6特異的IFN-γ+CD4+和IFN-T+CD8+T細(xì)胞的頻率相對(duì)rESAT-6單獨(dú)加鋁佐劑免疫組和空白組有顯著增加，HE6使用鋁佐劑組中ESAT-6特異的IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的頻率相對(duì)空白組有顯著增加，HE6不加佐劑組和使用鋁佐劑組中ESAT-6特異的IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的

15、頻率沒有顯著性差異。此結(jié)果與ELISPOT結(jié)果一致，這提示，HBc作為疫苗載體能有效地輔助增強(qiáng)結(jié)核抗原ESAT-6特異的細(xì)胞免疫，雖然疫苗結(jié)構(gòu)還有待優(yōu)化，但HE6是一種有前景的候選結(jié)核亞單位疫苗。
　　 綜上所述，本研究篩選到了一個(gè)較優(yōu)的HBc疫苗載體結(jié)構(gòu)(H144D)，優(yōu)化了相關(guān)的制備方法；通過插入炭疽表位，在小鼠和豚鼠模型上證明了HBc作為疫苗載體具有輔助增強(qiáng)特異性體液免疫的能力；通過插入結(jié)核抗原，在小鼠模型上證明了HBc作