N端無半胱氨酸斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的構建及蛋白質(zhì)N端標記的應用.pdf

1、蛋白質(zhì)是細胞功能的主要執(zhí)行者。在許多情況下，一個細胞功能的實現(xiàn)是多個蛋白質(zhì)分子相互作用的結果。近年來，隨著蛋白質(zhì)標記技術的不斷發(fā)展與成熟，對蛋白質(zhì)的研究進入了一個高速發(fā)展的階段。對它們的研究主要包括“體內(nèi)”和“體外”兩個方向。體外研究的重點是純化后的蛋白質(zhì)，將它們置于可控制的環(huán)境中，以期獲得它們的功能信息；而體內(nèi)研究實驗著重于蛋白質(zhì)在細胞或者整個組織中的活性作用，從而可以了解蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的場所和相應的調(diào)節(jié)機制。
　　 在體內(nèi)或

2、者體外的蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)修飾有利于幫助探究蛋白質(zhì)的生物功能和結構功能。目前對蛋白質(zhì)進行標記的方法主要有各種化學方法和利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子的反式剪接進行的標記。前者大多數(shù)相對簡單易行，可是存在許多不足之處，如特異性不強，化學標簽容易干擾被標記蛋白的活性，蛋白濃度要求較高等；后者是一項新興的蛋白質(zhì)標記技術，它雖然克服了化學標記的不足可是目前仍有融合蛋白不穩(wěn)定、溶解性較差、活性低和通用性差等急需解決的問題。本文在蛋白質(zhì)反式剪接的基礎上另辟蹊徑，

3、尋找內(nèi)部半胱氨酸較少的內(nèi)含子，對活性較高的內(nèi)含子我們利用定點突變、搭橋PCR等方法，構建斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，獲得活性較高的N末端(整個intein內(nèi)部)無半胱氨酸的內(nèi)含子，并通過SDS-PAGE，Western Blot等方法檢測蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性，然后利用實驗室的TM系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)內(nèi)含子作為標記手段的應用潛質(zhì)。最后選擇合適的蛋白進行N端特異性標記。
　　 本課題選取蛋白質(zhì)內(nèi)含子TerNdse-2、TX-S1、HaVol Po

4、l、Msm DnaB-1、Arsp FB24和PP-PhiEL ORF40進行蛋白質(zhì)N端標記的研究。其中Msm DnaB和Arsp FB24為3型蛋白質(zhì)內(nèi)含子，其余均為常見的1型蛋白質(zhì)內(nèi)含子。TerNdse、TX-S1(C1/S)、HaVol Pol、Msm DnaB-1和Arsp FB24的一位氨基酸分別為絲氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸，這些intein內(nèi)部半胱氨酸也非常少，有利于定點突變和后續(xù)標記的應用。
　　 首先對這些蛋

5、白質(zhì)內(nèi)含子的原始剪接活性進行檢測，在體內(nèi)pMTerNdse-2有微弱接活性，pMTX-S1(C1/S)有較高的剪接活性(本實驗室已研究，體內(nèi)和體外均由較高的剪接活性)，pMHP的剪接活性為100％，pMMD(C1突變成S后)有微弱的剪接活性，pMAF沒有任何剪接活性。
　　 接著對pMTerNdse-2、pMTX-S1(C1/S)和pMHP進行氨基酸定點突變，將其內(nèi)部的所有半胱氨酸通過搭橋PCR突變成絲氨酸，同時將pMMD內(nèi)部的

6、C1恢復。通過Western Blot檢測它們的剪接活性。pMTerNdse-2、pMTX-S1(C1/S)和pMHP在半胱氨酸完全突變后沒有任何剪接活性，pMMD有非常高的剪接活性。
　　 對pMHP，將其內(nèi)部的四個半胱氨酸分別突變成絲氨酸，我們發(fā)現(xiàn)第二個半胱氨酸可以決定其剪接活性，利用定點突變的方法選擇其側(cè)鏈基團相似的氨基酸進行替換，首先選擇蘇氨酸和甘氨酸進行替換，幸運的獲得了兩個內(nèi)部有剪接活性的無半胱氨酸的HP突變體、pM

7、HPG和pMHPT，為獲得一種通用性的標記intein奠定了基礎。
　　 通過和實驗室的蛋白質(zhì)內(nèi)含子進行比對等確定S1、S0和S11三個斷裂位點，構建pMTerNdse-2、pMMD、pMHP、pMHPG和pMHPT對應的S1、S0和S11體內(nèi)斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子。通過Western Blot檢測其剪接活性，pMTerNdse-2、pMHP和pMHPG三個斷裂intein沒有剪接活性，pMHPT-S1有較高的剪接活性；pMMD-S0

8、有100%的剪接活性。
　　 通過SWISS MODLE建模，Protean比對等，從新選擇了其它斷裂位點，pMHP、pMHPG和pMHPT選擇了10個新的斷裂位點F1-F10，pMMD重新選擇了5個斷裂位點F1-F5。通過Western Blot檢測其體內(nèi)剪接活性，結果顯示，pMHP-F2和F8有較高的剪接活性；pMHPT只有F2有剪接活性；pMMD只有F4有非常高的剪接活性。
　　 選擇pMHP-F2、pMHP-F8

9、、pMHPT-S1、pMHPT-F2、pMMD-SO、pMMD-F4和pMTX-S1(C1/S)幾個蛋白質(zhì)內(nèi)含子，構建含有N端前體蛋白或C端前體蛋白相應序列的表達質(zhì)粒，麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein，MBP)與IN組成的融合蛋白為N端前體蛋白；Ic與硫氧還蛋白(thioredoxin，T)組成的融合蛋白為C端前體蛋白。利用N端前體蛋白帶有的MBP標簽可以與Amylose resin特異性結合，C端前體蛋白

10、帶有的6×組氨酸標簽可以與Ni-NTA resin特異性結合，純化得到用于后續(xù)體外反應所需的N端前體蛋白和C端前體蛋白。
　　 將純化的N端前體蛋白與C端前體蛋白在摩爾比為1:1的條件下進行反應，通過Western印跡檢測剪接反應的活性，結果表明，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子pMTX-S1(C1/S)和pMMD-S0有部分剪接活性，其余蛋白質(zhì)內(nèi)含子的體外剪接活性還需要進一步實驗驗證。
　　 對有剪接活性的體外斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，我們選

11、擇TXS1在TM系統(tǒng)檢測其蛋白質(zhì)N端標記的應用。將TX-SIN構建到含有SUMO的PEDHC表達載體中，體外純化TX-S1N和TX-S1C蛋白，TX-S1N與巰基染料以1:5的比例反應4小時，通過透析袋透析掉未反應的染料，接著SUMO酶與L-X-S1N反應1小時，切除SUMO蛋白，將L-TX-S1和TX-S1C在體外剪接Buffer內(nèi)反應3小時，SDS-PAGE檢測，利用波長346-442納米的紫外觀察拍照。
　　 本課題不僅是

12、對前人研究的補充，同時還克服了化學合成和蛋白質(zhì)標記的不足之處，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的N-端特異性位點標記。為實現(xiàn)可控的、特異的、對目標蛋白影響小的對目標蛋白的標記及實際應用奠定了基礎。同時，我們發(fā)現(xiàn)了一種非常有意思的現(xiàn)象：pMHP和pMMD內(nèi)部一個非保守區(qū)的半胱氨酸竟然可以決定蛋白質(zhì)內(nèi)含子的活性，目前沒有相關文獻的報道，其化學和分子生物學機理值得繼續(xù)研究，相信是蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接理論知識的很好補充。另外，獲得了兩個活性非常高的內(nèi)部無半胱氨酸的蛋白