可調(diào)式光遺傳學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建及調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、光遺傳學(xué)技術(shù)利用基因編碼蛋白質(zhì)表達(dá)并結(jié)合光控和激光成像的手段為生物學(xué)研究提供了一種全新、無(wú)損、可逆、非侵入、超高時(shí)空分辨率的研究方法。光遺傳學(xué)的早期主要以神經(jīng)科學(xué)研究為主,利用第一代光遺傳學(xué)元件選擇性地觀察和控制腦中某類(lèi)細(xì)胞的特定神經(jīng)活動(dòng),并取得了前所未有的成果。而近年來(lái)隨著不同種類(lèi)的光遺傳學(xué)元件不斷地被發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)出來(lái),其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷地?cái)U(kuò)展。利用光遺傳學(xué)研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成為時(shí)下熱門(mén)研究方向,通過(guò)光控蛋白的變構(gòu)、寡聚和解聚來(lái)達(dá)到人為控制細(xì)

2、胞內(nèi)信號(hào)蛋白的活性進(jìn)而調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的,為人們研究細(xì)胞信號(hào)通路提供了極大的便利。除此之外,與其配套的研究工具:顯微成像系統(tǒng),光刺激系統(tǒng)以及相應(yīng)的數(shù)學(xué)分析方法也如雨后春筍一般涌現(xiàn)出來(lái),這些工具的出現(xiàn)更是使得光遺傳學(xué)的研究蓬勃發(fā)展起來(lái)。
  目前,利用基因工程和蛋白工程發(fā)現(xiàn)和改造的光遺傳學(xué)元件大致分為六類(lèi)。這些元件中的光敏蛋白吸收光子能量后發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),通過(guò)變構(gòu)和蛋白間的相互作用來(lái)控制標(biāo)靶蛋白的互作和定位。研究者利用這些模塊化的工

3、具可以實(shí)現(xiàn)光控細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路以及多種生理活動(dòng)的目的。
  在此背景下,本文首先自行開(kāi)發(fā)和搭建了一套可調(diào)式LED光刺激系統(tǒng),利用CRY2/CIBN這對(duì)光遺傳學(xué)元件結(jié)合環(huán)狀TIRFM顯微成像,實(shí)現(xiàn)可調(diào)式光控細(xì)胞內(nèi)PI3K(Phosphoinositide3-kinase)/PI(3,4,5)P3/Akt信號(hào)通路的研究,最后將這套系統(tǒng)運(yùn)用到A549肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitio

4、n,EMT)的調(diào)控研究當(dāng)中,課題的主要研究工作如下:
  (1)查閱文獻(xiàn),探討實(shí)驗(yàn)可行性。在開(kāi)展課題前閱讀大量文獻(xiàn),了解國(guó)內(nèi)外最新研究動(dòng)態(tài),對(duì)各研究?jī)?yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)和討論分析。確定本課題的研究思路,提出一種基于CRY2/CIBN元件的可調(diào)式光遺傳學(xué)研究方法,以及確定使用LED照明矩陣作為體外大規(guī)模光刺激的輔助照明工具,并結(jié)合時(shí)下腫瘤研究領(lǐng)域熱門(mén)的EMT作為應(yīng)用切入點(diǎn),進(jìn)行應(yīng)用研究。最后,對(duì)本課題的可行性進(jìn)行理論分析,并得出理論依據(jù)。

5、
  (2)設(shè)計(jì)并搭建LED光刺激系統(tǒng)?;谇懊娴奈墨I(xiàn)查閱以及理論分析,在低成本、低功耗、便捷和穩(wěn)定的條件下,設(shè)計(jì)搭建LED光刺激系統(tǒng)。選取460nn-465 nm的藍(lán)光LED燈珠作為光源,搭建一個(gè)4×4LED矩陣。使用STC89C52作為整個(gè)硬件裝置的MCU,焊接硬件電路。使用Visual C++6.0編寫(xiě)上位機(jī)控制程序,通過(guò)設(shè)置不同參數(shù)來(lái)操控LED矩陣的刺激模式。最后利用藍(lán)牙連接上位機(jī)與下位機(jī),實(shí)現(xiàn)無(wú)線通信,以便于在培養(yǎng)箱中使

6、用該刺激系統(tǒng)。
  (3)在Hela細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)可調(diào)式CRY2/CIBN元件調(diào)控PI3K/PI(3,4,5)P3/Akt信號(hào)通路。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,確定不同刺激強(qiáng)度的LED照明刺激方案,確定顯微成像時(shí)間,以及拍攝細(xì)胞曝光時(shí)間和信號(hào)時(shí)序。培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在單細(xì)胞情況下利用環(huán)狀TIRFM成像研究細(xì)胞內(nèi)PI(3,4,5)P3水平與光照強(qiáng)度的關(guān)系。大規(guī)模LED刺激下,利用免疫熒光和蛋白電泳等技術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平與光照強(qiáng)度的關(guān)系。

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