弓形蟲疫苗候選抗原IMP1生物學(xué)特性及其免疫原性研究.pdf

1、弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生繁殖的機會性致病病原體，可以感染包括人在內(nèi)的幾乎所有的溫血動物，嚴重威脅人類及動物健康。正常人感染弓形蟲后，大多數(shù)不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，呈隱性感染狀態(tài)，但對嬰兒或機體免疫力低下或免疫抑制時（AIDS、骨髓移植、器官移植等）可表現(xiàn)出嚴重的臨床癥狀，甚至可以引起死亡。妊娠期母畜感染該病，?？梢鹆鳟a(chǎn)，死產(chǎn)，木乃伊胎以及其它一些嚴重的臨床癥狀，造成嚴重的經(jīng)濟損失.目前，對于弓形蟲病的防治仍以預(yù)防為主，無特效藥物。因

2、此，研發(fā)切實有效的疫苗是防治的關(guān)鍵。IMP1蛋白是2011年剛發(fā)現(xiàn)的蛋白，被認為在弓形蟲病疫苗開發(fā)方面具有重要潛力.本研究通過分子生物學(xué)、基因工程學(xué)、免疫生物學(xué)等方法對弓形蟲IMP1的表達特性及免疫原性進行研究，探討IMP1及其相關(guān)蛋白的功能，為弓形蟲病防控提供新的思路與方法.
　　 1.浙江省動物弓形蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查
　　 為了解浙江省動物弓形蟲病的流行現(xiàn)狀，更好地為弓形蟲病的防治提供科學(xué)的依據(jù)，本項目組成員采集了

3、來自浙江省十一地市的813份豬血清、70份奶牛血清、151份山羊血清、213份犬血清及60份貓血清樣品，進行了弓形蟲病的血清流行病學(xué)調(diào)查.結(jié)果表明，豬的感染率最高，平均血清陽性率高達53.4％，其次為犬16.0％，貓13.3％及山羊2.7％.在對70份奶牛的血清進行檢測時，未有陽性樣品檢出.對采樣背景較為詳細的豬、犬、貓樣品的試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，該病的血清陽性率隨動物的年齡增長而顯著性升高.弓形蟲血清陽性率與飼養(yǎng)環(huán)境、動物

4、品種等相關(guān).本試驗首次對浙江省豬、奶牛、山羊、犬、貓弓形蟲血清陽性率進行較為詳細的調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示浙江省動物特別是豬的弓形蟲感染較為嚴重，鑒于目前尚無有效的疫苗用于該病的治療，因此制定合理的方案控制該病的傳播在浙江省動物弓形蟲的防控方面具有重要意義.
　　 2.基于SAG1基因弓形蟲熒光定量PCR檢測方法的建立
　　 熒光定量PCR因其高效敏感的特性在各種病原的檢測中得到廣泛應(yīng)用，然而其檢測效果與所選擇的目的基因密切相

5、關(guān).本研究根據(jù)GenBank上公布的弓形蟲RH株SAG1(又稱P30)基因(X14080)保守區(qū)域序列設(shè)計特異性引物，采用SYBR(R)greenⅠ熒光染料法建立弓形蟲的熒光定量PCR檢測體系.與傳統(tǒng)的PCR方法相比，該方法表現(xiàn)出更高的敏感性，最低可以檢測到一個弓形蟲速殖子.對人工感染小鼠的不同組織進行檢測，1天后各樣品即可被檢出（血液25％、脾臟50％、肺臟50％）.本方法特異性好，與新孢子蟲、大腸桿菌、牛巴貝斯蟲、布氏錐蟲、隱孢子蟲

6、、犬弓首蛔蟲DNA均無交叉反應(yīng).用建立的方法對臨床181份豬血進行檢測，有11份樣品檢測結(jié)果為陽性，比普通PCR的9份表現(xiàn)出更高的敏感性.研究結(jié)果表明，基于SAG1基因建立了一種可靠的弓形蟲SYBR(R) greenⅠ熒光定量PCR檢測方法，該方法的建立可為弓形蟲病理學(xué)、免疫學(xué)及治療方面的研究提供重要的技術(shù)支持.
　　 3.弓形蟲IMP1的表達特性研究
　　 弓形蟲IMP1是一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白，在雞球蟲、犬新孢子蟲中都有高

7、度保守的同源序列，本研究通過基因克隆技術(shù)用弓形蟲RH株為模板成功獲得了弓形蟲IMP1序列，將所擴增基因與GenBank上公布的弓形蟲ME49株(XM_002370108;2e-36)的序列進行相似性分析比較，分別在114(A-G)與342(T-C)處各有一個突變，序列相似性為99.8％，但對編碼氨基酸無影響.對所獲得的序列進行原核表達、純化，制備了兔源多克隆抗體.通過間接免疫熒光技術(shù)進一步對速殖子不同時期該蛋白的表達特性進行研究.研究結(jié)

8、果發(fā)現(xiàn)在游離、吸附于細胞表面、入侵中、入侵后及納蟲空泡中的速殖子IMP1均有表達，均被定位于蟲體表面，且在有些蟲體的頂端表達更為強烈.該研究為進一步闡明IMP1的功能奠定了基礎(chǔ).
　　 4.弓形蟲二價重組亞單位疫苗rSAG1-IMP1的免疫原性研究
　　 利用分子生物學(xué)技術(shù)分別構(gòu)建BL21-pET30a-IMP1及BL21-pET30a-SAG1-IMP1原核表達系統(tǒng)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達.用純化后的重組蛋白免疫I

9、CR小鼠，探討弓形蟲重組蛋白rSAG1-IMP1的免疫效果.按照每只小鼠100μg融合蛋白的劑量進行首免，2周后按照每只小鼠50μg融合蛋白的劑量進行二免，二免后兩周再加強免疫一次.分別于免疫前和首免后每2周小鼠眼眶采血分離血清進行抗體檢測，持續(xù)至三免后4周;三免后2周取脾臟，進行淋巴細胞增殖試驗和細胞因子檢測;三免后兩周用新鮮傳代的弓形蟲按500個速殖子/只的劑量攻毒，評價其免疫保護效果。結(jié)果表明各重組蛋白均能顯著提高機體對融合蛋白的

10、免疫應(yīng)答水平和淋巴細胞的增殖水平(P＜0.05):蛋白免疫組首免后4周抗體水平開始顯著上升，首免后6周即可達到較高水平.其中二價亞單位疫苗rSAG1-IMP1的抗體水平要顯著高于單價亞單位疫苗rIMP1和SAG1(P＜0.05).免疫后機體IgG1、IgG2a、IL-4、INF-γ水平均有所上升，但IgG1、IL-4更為明顯.攻蟲試驗表明各蛋白免疫組均能顯著延長小鼠的存活時間，弓形蟲重組二價亞單位疫苗rSAG1-IMP1較單價亞單位疫苗

11、具有更好的免疫效果.
　　 5.減毒沙門氏菌為載體傳遞弓形蟲IMP1基因的免疫原性研究
　　 研究利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了攜帶有弓形蟲IMP1基因的減毒沙門氏菌活載體核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1.將構(gòu)建的活載體核酸疫苗與空載減毒沙門氏菌ZJ111/pcDNA3.1免疫ICR小鼠，分別通過抗體水平檢測、抗體亞類檢測、淋巴細胞增殖試驗、細胞因子檢測以及攻蟲試

12、驗等，探討減毒沙門氏菌活載體核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1的免疫效果.結(jié)果表明:減毒沙門氏菌活載體核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強的體液及細胞免疫應(yīng)答，顯著提高機體INF-γ的分泌及IgG2a水平(P＜0.05)，對小鼠抵抗弓形蟲感染具有一定的免疫保護效果，可顯著延長小

13、鼠的存活時間(P＜0.05).而且二價核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1的免疫保護效果要顯著的好于單價核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1.
　　 綜上，本研究基于SAG1基因建立了一種可靠的弓形蟲SYBR(R) greenⅠ熒光定量PCR檢測方法，首次對浙江省豬、奶牛、山羊、犬、貓弓形蟲血清陽性率進行較為詳細的調(diào)查，通過制備IMP1多克隆抗體，應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)對弓形蟲速殖子感染不同階段的IM