副溶血性弧菌中密度感應(yīng)系統(tǒng)依賴(lài)的T3SS1和T6SS2調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種海洋微生物，主要生存于海水，港口水環(huán)境及附著在海產(chǎn)品上，人們主要通過(guò)食用未煮熟的污染的海產(chǎn)品而感染，目前副溶血性弧菌已經(jīng)成為引起食物中毒的首要病原菌。密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum-sensing，QS)是細(xì)菌中廣泛存在的細(xì)菌之間的信號(hào)傳遞機(jī)制，主要通過(guò)合成，釋放及感應(yīng)自身誘導(dǎo)因子(autoinducers，AI)來(lái)感受生存環(huán)境的變化，繼而調(diào)控與細(xì)菌菌密度相關(guān)的系列基

2、因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。副溶血性弧菌QS系統(tǒng)影響細(xì)菌很多生物學(xué)功能，如生物膜的形成，菌落透明度的變化，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力等。AphA和OpaR是副溶血性弧菌QS系統(tǒng)的2個(gè)主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，分別在低菌密度(low cell density，LCD)和高菌密度（high celldensity，HCD）時(shí)高表達(dá)，并介導(dǎo)細(xì)菌在LCD和HCD之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。
　　三型分泌系統(tǒng)(Type3 Secretion Systems，T3SS)是細(xì)菌蛋白分泌裝置，通

3、過(guò)把毒力效應(yīng)蛋白注射入宿主細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞損傷。副溶血性弧菌T3SS1以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞程序性死亡或自噬的方式介導(dǎo)細(xì)菌的細(xì)胞毒性。副溶血性弧菌六型分泌系統(tǒng)Ⅱ(Type6 Secretion Systems2，T6SS2)主要介導(dǎo)其對(duì)宿主細(xì)胞的粘附作用，粘附是細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用的首要步驟，是引起致病的必要條件。副溶血性弧菌T3SS1和T6SS2是其關(guān)鍵的的毒力因子，參與其致病的多種生物學(xué)功能。本課題著重研究QS中心調(diào)控子AphA和OpaR對(duì)

4、T3SS1和T6SS2的具體轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　副溶血性弧菌T3SS1主要受exsACDE操縱子的調(diào)控。在副溶血性弧菌近緣菌哈氏弧菌中，QS系統(tǒng)中心調(diào)控子LuxR通過(guò)抑制exsA基因的表達(dá)來(lái)間接抑制T3SS1的表達(dá)。但是在副溶血性弧菌中QS系統(tǒng)調(diào)控T3SS1的詳盡機(jī)制并未報(bào)道。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，副溶血性弧菌中QS系統(tǒng)可能也是通過(guò)作用于exsACDE操縱子來(lái)調(diào)控T3SS1的轉(zhuǎn)錄;且根據(jù)操縱子結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)我們確定了4個(gè)相應(yīng)的靶基因進(jìn)行研

5、究，exsC、exsB、exsD和VP1687（T3SS1效應(yīng)蛋白基因）。
　　副溶血性弧菌T6SS2受OpaR蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，OpaR蛋白促進(jìn)其表達(dá)，但是詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制并未報(bào)道。根據(jù)生物信息學(xué)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè):QS系統(tǒng)可能通過(guò)直接作用于T6SS2的基因簇來(lái)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。T6SS2基因簇由3個(gè)操縱子組成，我們選擇了每個(gè)操縱子的首位基因作為靶基因來(lái)進(jìn)行研究，即T6SS2的靶基因?yàn)閂PA1027、VPA1043和VPA1044。

6、
　　本研究利用自殺質(zhì)粒pDS132對(duì)aphA和opaR基因進(jìn)行了缺失，并以pBAD33質(zhì)粒為載體進(jìn)行了相應(yīng)基因的回補(bǔ)，利用pET蛋白表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(λDE3)中獲得了His-AphA和His-OpaR的重組蛋白，隨后用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)和DNA酶Ⅰ足跡實(shí)驗(yàn)（DNaseI footpriting assay）研究調(diào)控子與靶基因啟動(dòng)子區(qū)之間的

7、關(guān)系，并用引物延伸實(shí)驗(yàn)和LacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)研究調(diào)控子對(duì)靶基因的調(diào)控關(guān)系，繼而詳細(xì)闡述調(diào)控機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:AphA通過(guò)激活exsC、exsB和exsD基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)T3SS1(VP1687)的轉(zhuǎn)錄，繼而促進(jìn)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性;OpaR通過(guò)抑制exsC、exsB和exsD基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制T3SS1(VP1687)的轉(zhuǎn)錄，繼而抑制細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性。AphA和OpaR結(jié)合在 exsB基因的啟動(dòng)子區(qū)序列上，直

8、接調(diào)控其的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。AphA和OpaR對(duì)exsC和exsD的作用均是間接的。這個(gè)結(jié)果表明在菌密度較低時(shí)aphA大量表達(dá)從而促進(jìn)T3SS1表達(dá)，致使微量的細(xì)菌就可以引起感染;在菌密度較高時(shí)opaR抑制T3SS1的表達(dá)，使細(xì)菌對(duì)宿主的致病力下降，進(jìn)而促進(jìn)其排出宿主體外，利于細(xì)菌的傳播。
　　AphA間接負(fù)向調(diào)控VPA1027、VPA1043和VPA1044的轉(zhuǎn)錄從而抑制T6SS2的轉(zhuǎn)錄;OpaR結(jié)合于這3個(gè)靶基因的啟動(dòng)子區(qū)直接正向調(diào)控