PCR法檢測(cè)嗜水氣單胞菌基因診斷溺死.pdf

1、溺死（drowning）是指由于大量液體涌入人的呼吸道和肺泡內(nèi)，阻礙人體呼吸運(yùn)動(dòng)和氣體交換，引發(fā)機(jī)體各組織器官缺氧和二氧化碳的潴留，從而造成窒息而死亡。實(shí)際案例顯示，從水環(huán)境發(fā)現(xiàn)的死者大部分是由于意外溺水身亡，但亦有可能是自殺或他殺，甚至出現(xiàn)死后拋尸入水而隱藏真實(shí)死因的情況。所以水中尸體也許與刑事案件有關(guān)，水中尸體死因的判定已成為了法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中需要重點(diǎn)處理的問(wèn)題。目前硅藻檢驗(yàn)被界內(nèi)認(rèn)定是判定水中高腐尸體死因的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該法尚存在操作過(guò)

2、程有一定危險(xiǎn)，離心時(shí)容易導(dǎo)致硅藻耗損及空氣中存在硅藻的污染，致使判定結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性等不足，因此，該方法在法醫(yī)實(shí)踐中一直備受爭(zhēng)議。所以，研發(fā)其它相關(guān)溺死浮游生物以補(bǔ)充溺死鑒定證據(jù)，對(duì)于準(zhǔn)確鑒定死因是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。因而，該研究具有重要的理論意義與實(shí)踐意義。
　　水中的浮游生物通?？梢苑譃樗?xì)菌和藻類(lèi)。近年來(lái)依據(jù)水生細(xì)菌診斷溺死成為研究的熱點(diǎn)，尤其是嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophia），其為革蘭氏陰性菌

3、隸屬弧菌科，主要分布于淡水水體，是一種體積（0.2-2.0μm）比硅藻體積（2-200μm）小的浮游細(xì)菌。對(duì)于溺水者來(lái)說(shuō)，嗜水氣單胞菌更容易隨著溺液通過(guò)肺泡—毛細(xì)血管屏障入侵至肺血管進(jìn)入血液系統(tǒng)到達(dá)人體內(nèi)在器官。更重要的是，該菌可在溺死者體內(nèi)存活繁殖。因此，該菌可作為良好的溺死標(biāo)記物。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)特異性及靈敏度實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)篩選得到針對(duì)該菌的4對(duì)分別針對(duì)gyrB基因、16SrRNA基因、hly基因和aer基因的特異性引物。分別采用

4、PCR-PAGE法及PCR-CE法檢測(cè)分析41例實(shí)際案件尸體樣本中的嗜水氣單胞菌，以微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法檢出硅藻的結(jié)果作參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià) PCR-PAGE及 PCR-CE法檢測(cè)嗜水氣單胞菌基因在淡水溺死診斷評(píng)估及應(yīng)用的意義。
　　1、引物（特異性和靈敏性）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的檢驗(yàn)結(jié)果：
　　篩選得到的4對(duì)引物對(duì)人、白色念珠菌、16種藻類(lèi)DNA擴(kuò)增后檢測(cè)結(jié)果均沒(méi)有出現(xiàn) DNA條帶，僅嗜水氣單胞菌檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)目的基因條帶，其產(chǎn)物大

5、小分別為195 bp、350 bp、127 bp和175 bp，即4對(duì)引物均有良好的物種特異性。4對(duì)引物使用PCR-PAGE法可檢測(cè)樣本DNA模板量最低分別為10-2 ng、10-1 ng、10-3 ng和10-1 ng，使用的引物均具有較高的靈敏度；使用PCR-CE法可檢測(cè)樣本DNA模板量最低分別為10-5 ng、10-5 ng、10-5 ng和10-2 ng，PCR-CE法比PCR-PAGE法則顯示出更高的靈敏度。
　　2、建

6、立的檢驗(yàn)方法：
　　（1）PCR-PAGE法：4例陸地正常死亡案件尸體樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性；1例死后入水尸體的器官樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，僅對(duì)應(yīng)水樣檢測(cè)陽(yáng)性。而36例淡水溺死者的樣本肺、肝、腎和對(duì)應(yīng)水樣經(jīng)檢測(cè)，嗜水氣單胞菌的檢出率：AH分別為72.2％、22.2%、25.0%和27.8%；Ah分別為55.5%、27.8%、16.7%和25.0%；AHH分別為44.4%、13.9%、8.3%和13.9%；AER分別為47.2%、8.3

7、%、5.5%和11.1%。計(jì)算得到溺死者的體循環(huán)臟器中嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)的總陽(yáng)性率分別是30.6%、25.0%、16.7%、8.3%。PCR-PAGE對(duì)溺死有較強(qiáng)的指示作用，可作為一個(gè)初步篩選定性的手段。
　?。?）PCR-CE法：4例陸地正常死亡案件尸體樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性；1例死后入水尸體的器官樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，僅對(duì)應(yīng)水樣檢測(cè)陽(yáng)性。而4對(duì)引物對(duì)36例淡水溺死者的樣本肺、肝、腎和對(duì)應(yīng)水樣經(jīng)檢測(cè)，嗜水氣單胞菌的檢出率：AH分別為

8、97.2%、75.0%、61.1%和61.1%；Ah分別為69.4%、38.9%、33.3%和30.6%；AHH分別為97.2%、63.9%、55.5%和30.6%；AER分別為77.8%、38.9%、25.0%和25.0%。計(jì)算得到溺死者的體循環(huán)臟器中嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)的總陽(yáng)性率分別為86.1%、52.8%、83.3%和44.4%。PCR-CE法檢測(cè)嗜水氣單胞菌基因是一種新型鑒定淡水溺死的方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可直接作為診