東亞飛蝗抵抗真菌感染的免疫應答機制研究.pdf

1、宿主昆蟲在與病原微生物長期斗爭的過程中，進化出來一系列與植物、動物相似的固有免疫應答反應來抵抗病原微生物的感染。昆蟲的固有免疫應答反應主要包括：體壁的機械屏障作用、體液免疫和細胞免疫。昆蟲病原真菌是昆蟲重要的致病菌，病原真菌通過在宿主昆蟲體表附著和萌發(fā)啟動侵染，病原真菌一旦穿透宿主昆蟲體壁，即可以快速播散形成感染。因此，病原真菌與宿主昆蟲之間的斗爭猶如“矛和盾”的關系，病原真菌侵染宿主昆蟲的結果轉歸主要由宿主昆蟲的固有免疫應答反應和病原

2、真菌致病力之間的相互作用決定。詳細闡明宿主昆蟲抵抗真菌感染的固有免疫應答機制對于尋找更加有效的殺蟲靶標和開發(fā)更加高毒的工程真菌菌株以及設計害蟲防治策略具有極其重要的意義。
　　 以往研究多認為宿主昆蟲的固有免疫應答反應發(fā)生在真菌侵染穿透宿主昆蟲體壁的皮細胞層(epidermis)時，而本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)，在病原真菌綠僵菌侵染東亞飛蝗的早期(6-24小時)，感病蝗蟲體內出現(xiàn)大量基因發(fā)生表達變化，這就提示宿主昆蟲對病原真菌的固有免

3、疫反應的起始時間可能比我們想象的更早。另外，脂肪體和血細胞是被普遍承認的重要的固有免疫應答器官，但近年來也有文獻報道體壁、中腸等組織中也有免疫相關基因的表達，但究竟有哪些組織參與宿主昆蟲抵抗真菌感染目前尚無系統(tǒng)性研究。
　　 Toll信號通路是宿主昆蟲固有免疫應答反應中重要的體液免疫信號途徑。Toll信號通路是存在于從低等的線蟲到高等的哺乳動物中的一條保守信號通路，該通路在昆蟲體內可同時參與抵抗真菌和革蘭氏陽性細菌的感染。另外，

4、酚氧化酶系統(tǒng)是宿主昆蟲固有免疫應答反應中重要的細胞免疫途徑。β-1，3-葡聚糖識別蛋白(βGRP)是酚氧化酶系統(tǒng)上游主要識別真菌細胞壁成分β-1，3-葡聚糖的重要受體，βGRP對于β-1，3-葡聚糖的識別可以引起下游的酚氧化酶系統(tǒng)活化，進而調控昆蟲血細胞參與包裹和黑化病原微生物。對按蚊的研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾沉默βgrp基因后可以使得酚氧化酶信號通路激活障礙，進而抑制血細胞對細菌的黑化包裹作用，并導致按蚊的存活率降低；但是，對果蠅的研

5、究卻發(fā)現(xiàn)，將酚氧化酶信號通路中的酚氧化酶激活酶沉默后使得酚氧化酶激活障礙后，突變的果蠅仍和野生型果蠅一樣能夠抵抗真菌的感染，這就說明在果蠅中βGRP也可能并不參與抵抗真菌。由此可見，βgrp卻基因在不同的物種中功能較為復雜。
　　 由此可見，近年的研究已經(jīng)闡明了昆蟲防衛(wèi)真菌的多個信號途徑，但還未完全弄清昆蟲對真菌的防衛(wèi)反應時間、空間、參與的組織器官以及各種信號途徑在防衛(wèi)中的作用。想要了解主昆蟲何時以及如何啟動固有免疫應答反應以及

6、哪些組織參與抵抗真菌，可以通過分析Toll信號通路在抵抗真菌感染的過程中的激活時間和參與的組織器官進行探討。但是，Toll信號通路涉及的相關基因較多，如果要對宿主昆蟲啟動Toll信號通路的時空特點進行深入的研究，則需要從真菌孢子侵染早期至末期對昆蟲的多個免疫組織中Toll信號通路的變化進行研究，這樣形成的檢測樣本數(shù)量就會較多。因此，本研究首先建立了一種有效檢測多個基因在多個樣本中表達譜的方法，再以綠僵菌侵染直翅目昆蟲東亞飛蝗為材料，從綠

7、僵菌孢子在體壁萌發(fā)至侵染晚期，動態(tài)系統(tǒng)地研究了東亞飛蝗體內四個不同組織(脂肪體、血細胞、中腸和翅)中Toll信號通路相關基因的激活時間和表達變化情況，同時研究了通路中兩個重要基因Lmmyd88和Lmcactus的轉錄被干擾下調后東亞飛蝗抵抗真菌感染能力的變化情況。
　　 另外，本研究還首次克隆了直翅目昆蟲東亞飛蝗體內的βgrp基因，檢測了該基因在東亞飛蝗體內不同組織和不同發(fā)育時期的表達情況，研究了該基因在宿主昆蟲東亞飛蝗感染真菌

8、后的表達變化情況，同時還研究了通過RNA干擾使得該基因的轉錄下調后，宿主昆蟲東亞飛蝗的存活率的改變以及抵抗真菌感染能力的變化。
　　 主要研究結果有：
　　 1)建立了一種有效的檢測多重基因表達譜的技術，該技術不需要特殊儀器、操作簡便、成本低、靈敏度好，特別適合中等通量的基因表達譜檢測，該技術滿足后續(xù)實驗要求。
　　 2)克隆了東亞飛蝗體內Toll信號通路相關基因片段，包括：2個模式識別受體Lmgnbp-like

9、和Lmgnbp2，6個Toll信號通路相關基因Lmspatzle、Lmtoll9、Lm18wheeler、Lmmyd88、Lmtube和.Lmcactus。
　　 3)半定量RT-PCR顯示，上述8個基因在中腸中均有較高水平的表達，而脂肪體、血細胞和翅中表達則相對較低，另外，Lmspatzle基因只在翅和中腸中有表達，而在脂肪體和血細胞中無表達，Lmtoll9基因則只在中腸中有表達。
　　 4)Real-time PCR

10、結果顯示，綠僵菌侵染東亞飛蝗后，當綠僵菌在東亞飛蝗的翅表皮上萌發(fā)(侵染后8h)時，脂肪體中的Toll通路相關基因即呈上調表達。
　　 5)多基因表達譜檢測方法分析翅、脂肪體、血細胞和中腸四個免疫器官中。Toll信號通路相關基因激活情況，結果顯示，當綠僵菌在東亞飛蝗的翅表皮上萌發(fā)時，脂肪體中的Toll通路相關基因仍呈上調表達，結果與利用Real-time PCR檢測的結果一致；同時，模式識別受體Lmgnbp-like和Lmgnbp

11、2在翅中有上調表達，血細胞和翅中的Toll信號通路基因也呈上調表達，但時間晚于脂肪體中Toll信號通路相關基因的活化時間；但中腸中的Toll通路相關基因在真菌侵染的整個過程中未見明顯改變。
　　 6)RNA干擾實驗研究結果顯示，Toll信號通路基因Lmmyd88和Lmcactus轉錄下調后，東亞飛蝗抵抗真菌感染的能力發(fā)生了改變，Lmmyd88突變體抵抗真菌的能力下降，而Lmcactus突變體抵抗真菌的能力提高。
　　 7

12、)克隆獲得了β-1，3-葡聚糖識別蛋白基因(命名為Lmβgrp)，該基因全長cDNA為1656bp，預測蛋白分子量為53kD。
　　 8)半定量RT-PCR檢測結果顯示，生理狀態(tài)下，Lmβgrp卻在胚胎發(fā)育的整個階段都有表達，但在成蟲中僅在血細胞中有表達，而在脂肪體、中腸和翅等免疫器官中均無表達。
　　 9)定量PCR結果顯示，真菌侵染東亞飛蝗后，Lmβgrp基因及下游酚氧化酶信號通路中酚氧化酶蛋白基因(Lmppo)的轉

13、錄被誘導上調。
　　 10)RNA干擾實驗研究結果顯示，通過RNA干擾沉默Lmβgrp基因的轉錄后，東亞飛蝗的存活率低于未被干擾的野生組，且干擾組東亞飛蝗糞便出現(xiàn)異常的黑色稀便；感染真菌綠僵菌后，干擾組東亞飛蝗的存活率低于感染了綠僵菌的野生型東亞飛蝗。
　　 11)分析檢測東亞飛蝗腸道16s rRNA，發(fā)現(xiàn)Lmβgrp基因轉錄被干擾后，東亞飛蝗的腸道菌群種群發(fā)生改變，干擾組東亞飛蝗腸道內檢測到了異常的創(chuàng)傷弧菌(Hbrio

14、 vulnificus)。
　　 以上實驗結果說明，直翅目昆蟲東亞飛蝗體內也存在保守的固有免疫應答信號途徑Toll信號通路，且該通路是東亞飛蝗體內重要的抗真菌感染的信號途徑，宿主東亞飛蝗在真菌穿透體壁之前就能感知真菌在體表的萌發(fā)，進而快速激活體內多個組織(脂肪體、血細胞和體壁組織)中的Toll信號通路參與抵抗真菌的感染。另外，東亞飛蝗體內也保守存在模式識別受體β-1，3-葡聚糖識別蛋白基因Lmβgrp，該基因參與抵抗真菌感染；同