編碼CK2激酶底物的c1orf109基因結構與功能研究.pdf

1、癌癥是導致人類疾病死亡的主要原因之一。侵襲和轉移是惡性腫瘤細胞的基本生物學特征,也是導致癌癥患者死亡的主要原因。關于腫瘤細胞的侵襲和轉移的研究一直是生命科學的研究熱點,但長期以來其分子機制一直未得到完全闡明。
　　為了尋找參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移的相關基因,本課題組對細胞來源相同但轉移能力不同的兩個人肺腺癌細胞系的基因表達差異進行分析時,獲得了一個存在差異表達的cDNA片段。隨后,采用生物信息學方法、RACE(Rapid Ampl

2、ification of cDNA End)技術和DNA測序相結合的方法獲得了該基因的mRNA全序列。BLASTN比對結果顯示,該基因與Homo Sapiens Chromosome 1 OR F109(c1orf109,序列號為NM_017850.1)同源,是一個功能未知的新基因。為了進一步研究c1orf109基因的表達及生物學功能,在本文中將對該基因的轉錄調控、亞細胞定位、表達模式、及其在細胞增殖和細胞周期調控過程中的作用進行初步的

3、研究。此外,還對其潛在的相互作用分子進行了篩選和驗證。
　　本研究采用雙熒光素酶活性分析、凝膠電泳遷移率分析(EMSA)和染色質免疫沉淀(ChIP)分析等技術,對c1orf109基因啟動子區(qū)的順式作用元件和反式作用因子進行了確認。結果發(fā)現(xiàn),在c1orf109基因的啟動子區(qū)域內存在兩個關鍵的順式調控元件,CAATbox和TATAbox。同時,實驗結果還表明,c1orf109基因的5′非翻譯區(qū)可以特異地結合轉錄因子Sp1,轉錄因子Sp

4、1參與c1orf109基因的轉錄調控過程。
　　為分析c1orf109基因產物的生物學功能,本研究首先對蛋白C1ORF109的基本理化性質、親疏水性、高級結構、功能結構域和磷酸化位點進行了生物信息學預測,提示C1ORF109可能是蛋白激酶CK2的底物,其第104、134、182位絲氨酸殘基是其潛在的磷酸化位點。在C1ORF109蛋白定位分析中,通過免疫熒光和細胞組分分離等實驗證實,C1ORF109主要定位于細胞核和細胞質。實驗結果

5、亦證實了C1ORF109是一個磷酸化蛋白質,并可在體外被CK2激酶特異的磷酸化,CK2激酶對C1ORF109的磷酸化不影響后者在細胞內的定位。
　　為明確c1orf109基因與腫瘤的關系,本研究還采用免疫印跡和實時定量PCR等方法對肝癌臨床病例組織、乳腺癌細胞系、肺癌細胞系、黑色素瘤細胞系中c1orf109基因的表達情況進行了分析。結果顯示,肝癌組織c1orf109基因mRNA表達增高,蛋白表達與mRNA表達一致。而且C1ORF1

6、09蛋白在多種腫瘤細胞系中均呈現(xiàn)表達增高的趨勢。結合C1ORF109在腫瘤中表達上調的特點和CK2激酶在細胞增殖調控中的作用,我們進一步分析了c1orf109基因在細胞增殖、細胞周期調控和腫瘤細胞轉移過程中的作用。pcDNA3.1-c1orf109重組體穩(wěn)定轉染乳腺癌Hs578T細胞,在集落形成實驗中,過表達外源C1ORF109重組蛋白的細胞所形成的集落數(shù)明顯增多(P<0.05),PCNA(增殖細胞核抗原)和cyclinD1的表達水平呈

7、上升趨勢,流式分析結果顯示,過表達外源C1ORF109重組蛋白的細胞G0/G1期細胞所占比例明顯減少,侵襲小室結果顯示過表達外源C1ORF109重組蛋白的細胞侵襲能力增強(P<0.05)。同時,運用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術,證實在特異性沉默乳腺癌MDA-MB-231細胞c1orf109基因的表達后,細胞的增殖能力明顯受到抑制,PCNA和cyclinD1的表達下調,出現(xiàn)G1期阻滯,侵襲能力降低(P<0.

8、05),這些結果再次證實了c1orf109基因在細胞增殖和周期調控,以及腫瘤細胞轉移過程中的作用。
　　利用原核表達的GST-C1ORF109重組蛋白對HeLa細胞的全細胞裂解液進行GSTpull-down分析,差異條帶經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)分析后得到多種與C1ORF109蛋白有潛在相互作用的蛋白因子,并采用免疫熒光共定位和免疫共沉淀的方法證實了C1ORF109與MARVELD1蛋白之間的相互作用,二者間的相互作