G蛋白抑制性α亞基Gαi1-3在腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要作用.pdf

1、目的：G蛋白參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是生物體內(nèi)非常保守且重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。目前多數(shù)研究認(rèn)為G蛋白以G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的形式參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們課題組先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，G蛋白抑制性α亞基1/3（Gαi1/3）以一種新的方式參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，即Gαi1/3參與到表皮生長(zhǎng)因子（EGF）及其受體EGFR和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）及其受體KGFR激活下游AKT-mTORC1信號(hào)，并在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。生長(zhǎng)因子信號(hào)激活后，Gαi1/3與生

2、長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）相關(guān)結(jié)合蛋白1（Gab1）以及生長(zhǎng)因子受體形成復(fù)合物，且在生長(zhǎng)因子受體對(duì)Gab1的磷酸化過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。BDNF是神經(jīng)系統(tǒng)中十分重要的營(yíng)養(yǎng)因子，探究Gαi1/3是否在BDNF及其受體TrkB激活的下游信號(hào)通路中起到重要作用，并初步探索Gαi1/3對(duì)小鼠行為表型的影響。
　　方法：野生型（WT）和Gαi1/3雙敲除型（DKO）小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs），Gαi1單敲除的MEF細(xì)胞，Gαi3單

3、敲除的MEF細(xì)胞，野生型（WT）分別轉(zhuǎn)入干擾Gαi1和Gαi3表達(dá)的siRNA的MEF細(xì)胞，Gab1敲除的MEF細(xì)胞，作為我們研究的主要細(xì)胞模型。用BDNF分別處理WT和DKO兩種MEF細(xì)胞，用Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中下游接頭蛋白Gab1以及MAPK/ERK信號(hào)通路（Erk）和AKT-mTORC1信號(hào)通路（Akt，S6，mTOR，GSK3α/3β）的活化水平。檢測(cè)WT、Gαi1-KO、Gαi3-KO和 Gαi1/3-DKO

4、四種細(xì)胞在 BDNF處理后下游信號(hào)的活化水平差異。檢測(cè) WT、Gαi1-siRNA、Gαi3-siRNA、DKO四種MEF細(xì)胞在BDNF刺激后下游信號(hào)的活化水平差異。在DKO MEF細(xì)胞中重新轉(zhuǎn)入Gαi1和Gαi3，檢測(cè)這兩種細(xì)胞與WT、DKO MEF在BDNF刺激后的下游信號(hào)的活化水平差異。利用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)小鼠腦立體定位，于ICR小鼠海馬區(qū)注射干擾病毒，檢測(cè)小鼠行為學(xué)變化。
　　結(jié)果：Western Blot結(jié)果顯示，與

5、野生型（WT）MEF相比，Gab1敲除的MEF細(xì)胞，表現(xiàn)出下游MAPK/ERK信號(hào)通路（Erk）和AKT-mTORC1信號(hào)通路（Akt Ser473/ Thr308，S6，mTOR）活化水平大幅度降低甚至缺失，說(shuō)明與我們?cè)贓GF和KGF上的研究類似，Gab1在BDNF信號(hào)通路中也起到重要作用。與野生型（WT)MEF相比，雙敲除型（DKO）MEF表現(xiàn)出BDNF刺激后下游銜接蛋白Gab1以及MAPK/ERK信號(hào)通路（Erk）和AKT-mTO

6、RC1信號(hào)通路（Akt，S6，mTOR，GSK3α/3β）活化水平大幅度降低甚至缺失。與WT MEF相比，Gαi1-siRNA、Gαi3-siRNA、Gαi1-KO、Gαi3-KO的MEF細(xì)胞在BDNF刺激后下游信號(hào)均有輕微減弱，Gαi2-KO的MEF細(xì)胞在BDNF處理后，下游信號(hào)沒(méi)有顯著變化。而DKO MEF中重新轉(zhuǎn)入Gαi1和Gαi3后，在BDNF刺激下，下游信號(hào)活化有明顯的提高。這些均說(shuō)明Gαi1和Gαi3在BDNF介導(dǎo)的信號(hào)通路