GSK-3β-β-catenin信號通路在磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討氯化鋰（LiCl），糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的一種選擇性抑制劑，對鈦顆粒誘導(dǎo)炎癥性骨溶解的治療作用。
　　方法：雌性C57BL/6小鼠84只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對照組（Control），Ti顆粒組（Ti組），LiCl低劑量治療組（L-LiCl組）和高劑量治療組（H-LiCl組），每組21只小鼠。Control組僅接受假手術(shù)，術(shù)后每天灌胃300μl等滲鹽水；Ti組在小鼠顱骨表面植入Ti顆粒，術(shù)后每天灌胃

2、300μl等滲鹽水；L-LiCl和H-LiCl組，Ti顆粒植入后，分別灌胃50或200 mg kg-1d-1LiCl。給藥2周后，使用CO2箱處死小鼠，保留顱骨及外周血，分別行micro-CT、組織病理學(xué)染色、RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、放射免疫分析、血常規(guī)及血生化等檢測。
　　結(jié)果：Micro-CT結(jié)果顯示治療組顱骨骨溶解現(xiàn)象明顯減輕，骨密度、骨體積、骨體積分?jǐn)?shù)L-LiCl組和H-LiCl組分別比Ti組增加23

3、.8％、51.7%，18.1%、45.8%，21.7%、43.9%；骨陷窩數(shù)減少了37.5%和59.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。H&E染色結(jié)果表明，Ti組骨膜內(nèi)有大量巨噬樣細(xì)胞，L-LiCl組和H-LiCl組炎癥反應(yīng)明顯減輕。Ti組骨溶解面積（BES）和顱骨厚度（BT）分別為（0.13±0.03）mm2、（0.12±0.04)mm，L-LiCl組和H-LiCl組分別為（0.07±0.01）mm2、（0.04±0.008）mm

4、2，（0.16±0.03)mm、（0.22±0.11）mm，與 Ti組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）?？咕剖崴嵝粤姿崦溉旧═RAP）結(jié)果顯示，Ti組顱骨溶解側(cè)可見大量TRAP陽性細(xì)胞，治療后 TRAP陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明 LiCl能增加pSer9-GSK-3β、β-catenin、ALP、Osterix和OPG的表達(dá)，抑制RANKL、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，而不影響GSK-3β的表達(dá)

5、。RT-PCR結(jié)果顯示，Ti顆粒顯著上調(diào)破骨細(xì)胞活化相關(guān)基因Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR mRNA的表達(dá)，經(jīng)治療后，上述基因mRNA表達(dá)水平降低，與Ti組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。Ti顆粒能抑制β-catenin和axin-2基因mRNA的表達(dá)，阻斷GSK-3β后β-catenin和axin-2基因mRNA的表達(dá)明顯增加。ELISA結(jié)果表明，LiCl能促進(jìn)OPG的分泌，抑制RANKL的表達(dá)，降低RANKL/OP

6、G比值，與Ti組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。Ti組I型膠原羧基末端肽（CTX）的表達(dá)量為50.72±7.88ng/ml，與Control組36.97±7.85ng/ml比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；L-LiCl組和 H-LiCl組 CTX表達(dá)量分別為52.20±3.86ng/ml和53.38±8.54ng/ml，與Ti組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。Ti組I型前膠原氨基端肽（P1NP）和骨鈣素（OCN）的表達(dá)

7、量分別為42.63±6.31ng/ml和41.40±7.76ng/ml，與LiCl治療組[L-LiCl組：52.53±9.07ng/ml、49.92±5.54ng/ml，H-LiCl組：62.70±9.43ng/ml、58.97±9.62ng/ml]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。Ti組顱骨體外培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯增加，LiCl能抑制上述因子的表達(dá)，且抑制作用呈劑量依賴性（p<0.05）。血常規(guī)

8、和血生化結(jié)果顯示藥物組白細(xì)胞數(shù)量，血紅蛋白含量，血小板數(shù)量，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血尿素氮和肌酐的含量與Ti組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　結(jié)論：氯化鋰通過調(diào)節(jié)GSK-3β/β-catenin信號通路，促進(jìn)新骨形成，抑制骨吸收，減輕磨損顆粒引起的炎癥性反應(yīng)，抑制骨溶解。
　　第二部分鈦顆粒調(diào)控GSK-3β/β-catenin信號通路抑制成骨細(xì)胞分化
　　目的：觀察Ti顆粒對成骨細(xì)胞分化、炎癥因子

9、釋放以及RANKL和OPG表達(dá)的影響，探討GSK-3β/β-catenin在磨損顆粒調(diào)控成骨細(xì)胞功能中的作用。
　　方法：以小鼠前成骨細(xì)胞系 MC3T3-E1為研究對象，分別以 Ti顆粒，GSK-3β的靶向抑制分子（LiCl）和（或）β-catenin靶向抑制因子（槲皮素）處理。CCK-8法檢測MC3T3-E1細(xì)胞增殖率；對硝基苯磷酸鹽實(shí)驗(yàn)檢測ALP活性，茜素紅染色檢測細(xì)胞礦化能力；RT-PCR檢測Runx2、Osterix、OC

10、N、RANKL、OPG、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、β-catenin和 axin-2基因 mRNA含量，Western blot檢測 GSK-3β、pSer9-GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)，免疫熒光染色觀察β-catenin的亞細(xì)胞定位，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)錄活性，ELISA檢測RANKL、OPG、IL-6和PGE2的表達(dá)。
　　結(jié)果：CCK-8結(jié)果表明0.1m

11、g/ml Ti顆粒對MC3T3-E1細(xì)胞活性無影響。共培養(yǎng)3d時(shí)，Ti組（0.1mg/ml）ALP活性（26.7±2.9 nmol PNPP/min/μg protein）與Control組（37.9±4.2nmol PNPP/min/μg protein）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；Ti組Runx2、Osterix和OCN基因mRNA表達(dá)明顯減少，與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；茜素紅染色結(jié)果提示

12、 Ti組紅色深染區(qū)域明顯減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ti作用后，MC3T3-E1細(xì)胞中pSer9-GSK-3β的表達(dá)下降，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量減少，Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)錄活性明顯降低。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ti組β-catenin和axin-2基因mRNA的含量較Control組分別下降了48.6%和45.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。加入LiCl（10mM）后，pSer9-GSK-3β表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞核內(nèi)β-

13、catenin含量增加，Wnt/β-catenin信號通路被活化。阻斷GSK-3β后，ALP活性上升了31.2%，Runx2、Osterix和OCN基因mRNA含量明顯增加，茜素紅染色結(jié)果也提示LiCl干預(yù)后礦化結(jié)節(jié)明顯增多，與Ti組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。以β-catenin靶向阻斷劑（50μm槲皮素）處理后，LiCl對Wnt/β-catenin信號通路的活化明顯減弱，該通路下游靶基因axin-2的表達(dá)顯著減少（p<0

14、.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，LiCl能促進(jìn)OPG的表達(dá)，抑制 RANKL的表達(dá)；ELISA檢測結(jié)果顯示，Ti+LiCl組 RANKL和OPG的含量分別為11.24±2.16pg/ml和2.45±0.32ng/ml，與 Ti組（RANKL：17.36±2.28pg/ml；OPG：0.67±0.17ng/ml）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；RANKL/OPG的比值由(25.75±3.21)/103(Ti組)下降到(4.76±0

15、.89)/103（Ti+LiCl組）（p<0.05）。Ti作用后MC3T3-E1細(xì)胞中TNF-α和IL-β的表達(dá)沒有顯著變化，IL-6和COX-2基因mRNA的含量與Control組比較分別增加了6.6倍和3.4倍，抑制GSK-3β后，IL-6和COX-2基因mRNA的表達(dá)顯著降低。ELISA結(jié)果顯示Ti組IL-6和PGE2的含量分別為694.86±81.59pg/ml和17.68±1.63ng/ml，與 Ti+LiCl組（IL-6：2

16、62.82±41.91pg/ml；PGE2：7.32±1.18ng/ml）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：磨損顆粒通過活化GSK-3β，阻斷β-catenin的核轉(zhuǎn)位，抑制MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化，上調(diào)RANKL/OPG比值，促進(jìn)炎癥因子IL-6和COX-2/PGE2的表達(dá)。LiCl通過活化β-catenin信號通路，下調(diào)RANKL/OPG的比值，抑制炎癥因子IL-6和COX-2/PGE2的表達(dá)，并能夠阻斷

17、Ti對成骨細(xì)胞分化的抑制作用。
　　第三部分氯化鋰調(diào)控成骨細(xì)胞抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化
　　目的：觀察LiCl干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞來源的條件培養(yǎng)基（Li-CM）對磨損顆粒誘導(dǎo)炎癥性破骨細(xì)胞活化的影響。
　　方法：以小鼠單核/巨噬細(xì)胞系 RAW264.7為研究對象，運(yùn)用條件培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)，觀察Li-CM對RANKL（50ng/ml）和Ti顆粒（0.1mg/ml）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化的影響。以抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP

18、）染色檢測成熟破骨細(xì)胞；以骨吸收培養(yǎng)板檢測破骨細(xì)胞骨吸收能力；以RT-PCR檢測Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR、NFATc1、MMP-9、TNF-α和IL-1β基因mRNA含量；Western blot檢測NFATc1、MMP9、IκBα和p-IκBα表達(dá)水平；ELISA檢測TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：TRAP染色結(jié)果顯示OB-CM組、Ti-CM組均可見大量的紫紅色多核細(xì)胞，Li-CM組多核細(xì)胞較少，

19、統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明 Li-CM（50%）組 TRAP陽性細(xì)胞數(shù)量（138.8±14.7個(gè)/cm2）與Li-CM（0%）組（228.3±22.4個(gè)/cm2）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。RT-PCR結(jié)果顯示Li-CM組破骨細(xì)胞活化相關(guān)基因Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR、NFATc1和MMP-9表達(dá)量顯著降低，與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。骨吸收培養(yǎng)板結(jié)果顯示Li-CM（50%）組骨吸收面積比較

20、Control組下降了50.8%（p<0.05）。Li-CM（50%）干預(yù)后TNF-α和IL-1β基因mRNA含量顯著下降，與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；ELISA結(jié)果顯示Li-CM（50%）組TNF-α和IL-1β的含量分別為481.4±62.8pg/ml和244.2±31.9pg/ml，與Control組（637.9±82.3pg/ml和315.7±37.5pg/ml）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05