人臍血基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)造血細(xì)胞歸巢植入及支持造血重建的實驗研究.pdf

1、造血微環(huán)境（hematopoietic inductive microenvironment，HIM）是支持和調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞（haemopoietic stem/progenitor cell，HSPC）生長發(fā)育的內(nèi)環(huán)境，其結(jié)構(gòu)和功能的完整統(tǒng)一是維系造血功能正常進(jìn)行的重要環(huán)節(jié)。作為造血微環(huán)境的重要組成部分，基質(zhì)細(xì)胞可能通過形成造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）生長的“龕”，分泌造血生長因子（hema

2、topoietic growth factor，HGF）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）等參與造血細(xì)胞的自我更新、增殖分化和歸巢定位，在免疫調(diào)節(jié)方面也具有重要的作用。深入探討基質(zhì)細(xì)胞對骨髓造血功能的影響，從修復(fù)或重建骨髓微環(huán)境正常功能入手治療造血功能損傷具有重要的理論價值和實際意義。
　　 基質(zhì)細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymAlstem cell，MSC）分化而來，是一個包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)

3、皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞等成分復(fù)雜的異質(zhì)細(xì)胞群。自1977年Dexter在體外培養(yǎng)出人骨髓基質(zhì)細(xì)胞（human bone marrow stromalcells，hBMSCs）獲得成功后，人們對hBMSCs 進(jìn)行了深入的研究。經(jīng)實驗研究和臨床實踐證實，hBMSCs 體外培養(yǎng)擴(kuò)增聯(lián)合HSC 回輸是重建造血功能的有效方法。但hBMSCs 來源受限，采集骨髓增加供者痛苦和風(fēng)險，且細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨供者年齡增加而下降

4、。自體移植中患者自身基質(zhì)細(xì)胞存在異常，而異體移植亦有可能帶來移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）等免疫相關(guān)問題，均限制了hBMSCs在臨床上的廣泛運用。
　　 人臍血來源豐富，取材方便，具有未成熟的干/祖細(xì)胞比例高且免疫原性較低等特點，在多種造血系統(tǒng)惡性疾病臨床治療中具有潛在的應(yīng)用價值。本課題組長期從事人臍血源基質(zhì)細(xì)胞（human umbilicAlcord blood-derived

5、stromAlcells，hUCBDSCs）及臍血造血微環(huán)境的研究，前期研究通過特定的細(xì)胞因子使hUCBDSCs 得以有效擴(kuò)增，擴(kuò)增后的hUCBDSCs在細(xì)胞成分和免疫表型上與hBMSCs 相似，能夠分泌表達(dá)多種細(xì)胞因子，具備造血基質(zhì)細(xì)胞的基本特征。以hUCBDSCs為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系能有效支持臍血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增，特別對于促巨核細(xì)胞集落形成單位（colony formingunit-megakaryocte，CFU-Mk）形成的

6、作用明顯優(yōu)于hBMSCs，提示hUCBDSCs在促進(jìn)巨核系增殖分化成熟方面可能具有重要的意義。深入探討hUCBDSCs 移植在體內(nèi)支持和調(diào)控造血、重建造血微環(huán)境的作用可為造血功能損傷修復(fù)治療提供新的思路?；谏鲜龇治?，本課題首先建立兩種不同來源基質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層（hUCBDSCs和hBMSCs）培養(yǎng)體系，采用CCK-8 法和Transwell 法分別觀察兩種基質(zhì)細(xì)胞對臍血單個核細(xì)胞（human umbilicAlcord mononucle

7、ar cells，hUCB-MNCs）增殖、粘附和遷移的影響，并采用RT-PCR 法檢測hUCBDSCs對歸巢相關(guān)分子mRNA的表達(dá)情況。在此基礎(chǔ)上建立BABL/c小鼠造血微環(huán)境輻照損傷模型，采用hUCB-MNCs 單移植，或分別聯(lián)合兩種不同來源基質(zhì)細(xì)胞共移植的方法，比較觀察兩種基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)造血細(xì)胞體內(nèi)歸巢與植入、重建造血微環(huán)境及支持造血重建的作用，為安全有效的臨床移植治療提供新的輔助措施和手段。
　　 方法：
　　 1

8、.體外構(gòu)建hUCBDSCs和hBMSCs兩種不同來源基質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)體系。采用CCK-8 法和Transwell 法分別檢測兩種基質(zhì)細(xì)胞對hUCB-MNCs 體外增殖、粘附和遷移的影響；采用RT-PCR 法檢測hUCBDSCs對歸巢相關(guān)因子（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA的表達(dá)情況。
　　 2.以近交系BABL/c小鼠作為受體鼠，經(jīng)60CO γ 射線致死劑量8.5

9、 Gy 全身照射預(yù)處理后分別接受不同劑量hUCB-MNCs （2、4、6 或8×106/只）單移植，或聯(lián)合hUCBDSCs （2×106/只）共移植，移植后第6周流式細(xì)胞儀檢測小鼠骨髓人源CD45+細(xì)胞植入率。
　　 3.采用CM-DiI 熒光染料預(yù)染hUCB-MNCs，輻照后BABL/c小鼠分別接受hUCB-MNCs （2×106/只）單移植，或聯(lián)合兩種不同來源基質(zhì)細(xì)胞（2×106/只）共移植。激光共聚焦顯微鏡追蹤觀察移植后熒

10、光標(biāo)記hUCB-MNCs在小鼠體內(nèi)的遷移分布情況，比較各組造血細(xì)胞歸巢率。
　　 4.輻照后小鼠分別接受hUCB-MNCs （2×106/只）單移植，或聯(lián)合兩種不同來源基質(zhì)細(xì)胞（2×106/只）共移植。觀察移植后各組小鼠存活情況，記錄生存率；動態(tài)檢測外周血血象恢復(fù)情況，骨髓組織病理切片觀察骨髓病理變化；不同時相點計數(shù)各組小鼠骨髓成纖維細(xì)胞集落形成單位（CFU-F）、脾集落形成單位（CFU-S）、粒/巨噬細(xì)胞集落形成單位（CFU-

11、GM）和巨核細(xì)胞集落形成單位（CFU-Mk）產(chǎn)率。
　　 結(jié)果：
　　 1.hUCBDSCs對臍血單個核細(xì)胞體外增殖、粘附和遷移能力的影響
　　 同hBMSCs 共培養(yǎng)組和hUCB-MNCs 單獨培養(yǎng)組相比較，hUCB-MNCs在hUCBDSCs 共培養(yǎng)條件下增殖能力顯著增強(qiáng)。兩種基質(zhì)細(xì)胞均能促進(jìn)hUCB-MNCs的粘附，且共培養(yǎng)后hUCB-MNCs 遷移能力也顯著（P<0.05）強(qiáng)于無基質(zhì)細(xì)胞支持對照。hUCB

12、DSCs 明顯表達(dá)與造血細(xì)胞歸巢植入密切相關(guān)的粘附分子、細(xì)胞因子及受體（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA，揭示其對造血細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢和植入具有重要作用。
　　 2.hUCBDSCs 聯(lián)合移植促進(jìn)造血細(xì)胞歸巢和植入
　　 輻照后小鼠分別接受不同劑量hUCB-MNCs （2、4、6 或8×106/只）單移植，或聯(lián)合hUCBDSCs （2×106/只）共移植。采用

13、不同劑量的hUCB-MNCs 單移植后的植入率隨hUCB-MNCs 輸注量增加而增長。hUCBDSCs 聯(lián)合移植能不同程度提高小鼠骨髓中人CD45+細(xì)胞植入比例，尤其當(dāng)輸注低劑量hUCB-MNCs （2×106/只）時，hUCBDSCs共移植較單移植的植入率提高最為顯著。激光共聚焦顯微鏡下觀察CM-DiI 標(biāo)記的hUCB-MNCs在移植后2～3天主要歸巢至骨髓和脾臟。移植后48小時，hUCBDSCs共移植組歸巢率顯著（P<0.05）高于

14、hBMSCs 共移植組和單移植組，顯示移植后早期hUCBDSCs能促進(jìn)造血細(xì)胞向骨髓遷移歸巢。
　　 3．hUCBDSCs 聯(lián)合移植修復(fù)受損微環(huán)境，支持造血重建
　　 兩種基質(zhì)細(xì)胞共移植組在移植后均能促進(jìn)小鼠存活，血象恢復(fù)較快，在移植后28天內(nèi)恢復(fù)至照射前水平。其中，hUCBDSCs 共移植組 血小板受抑程度較輕，回升也較快，并于移植后21天恢復(fù)至照射前水平；h BMSCs 共移植組白細(xì)胞于移植后10天迅速回升，在此后恢

15、復(fù)趨勢高于hUCBDSCs 共移植組；共移植兩組間血紅蛋白變化趨勢無顯著性差異。hUCBDSCs 聯(lián)合移植移植后促進(jìn)骨髓組織恢復(fù)，重建受損微環(huán)境，提高CFUs （CFU-F，CFU-S，CFU-GM，CFU-Mk）產(chǎn)率，特別是CHU-Mk 數(shù)量較hBMSCs 聯(lián)合移植增多，提示hUCBDSCs對于促巨核系增殖分化具有重要作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.hUCBDSCs能促進(jìn)臍血單個核細(xì)胞增殖、粘附和遷移，且促增殖能力較h