2型固有淋巴細(xì)胞在糖尿病性腎臟疾病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥,以腎小球肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增多,小血管玻璃樣變等為主要病理特點(diǎn),臨床特征以微量白蛋白尿到大量蛋白尿伴腎功能損害為主要表現(xiàn)。DKD是我國(guó)終末期腎臟疾病發(fā)生的第二位常見(jiàn)原因,也是西方國(guó)家終末期腎臟疾病需要透析治療的主要原因。然而,DKD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,尚不完全明確,目前的研究顯示DKD是慢性低度炎癥性疾病,Th1/Th2失衡等免疫因素在其

2、發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。2型固有淋巴細(xì)胞(type2innate lymphoid cell,ILC2)屬于固有淋巴細(xì)胞家族,可以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORα和GATA3,能產(chǎn)生2類細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-9、IL-13),介導(dǎo)2型免疫應(yīng)答,作為固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁,ILC2在炎癥、組織的重塑及修復(fù)中發(fā)揮十分重要的作用。然而,目前ILC2在DKD的作用研究尚少,因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)DKD患者外周血ILC2及其分泌的2類細(xì)胞因子

3、(IL-4、IL-5、IL-13)的檢測(cè)以及用這些細(xì)胞因子刺激體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞來(lái)研究ILC2在DKD發(fā)病中的作用。
　　方法：1.正常對(duì)照者(NC組)、2型糖尿病患者(DM組)、早期糖尿病腎病患者(DKD1組)、晚期糖尿病腎病患者(DKD2組)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中ILC2的比例通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2.NC組、DM組、DKD1組、DKD2組血漿IL-4、IL-5、IL-13的水平通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(E

4、LISA)法進(jìn)行測(cè)定。3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及分組：體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞,以IL-4、IL-13及高糖作為刺激因素,通過(guò)檢測(cè)纖維化因子來(lái)體外模擬ILC2在糖尿病腎臟的作用。按如下所述分組：(1)正常對(duì)照組(normal control group,NC組)：DMEM/F12培養(yǎng)基;(2)不同濃度IL-4組：1ng/mlIL-4組、10ng/mlIL-4組、100ng/mlIL-4組;(3)不同濃度IL-13組：1ng/mlIL-13組、1

5、0ng/mlIL-13組、100ng/mlIL-13組;(4)高糖組(high glucose group,HG組)：含30mmol/L葡萄糖;(5)IL-4+高糖組(HG+IL-4組)：100ng/mlIL-4+30mmol/L葡萄糖;(6)IL-13+高糖組(HG+IL-13組)：1ng/ml IL-13+30mmol/L葡萄糖。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法：(1)觀察IL-4對(duì)體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞纖維化的作用：用不同濃度IL-4(1n

6、g/ml、10ng/ml、100ng/ml)刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞不同時(shí)間(24h、48h),ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和纖維連接蛋白(FN)的水平,q-PCR檢測(cè)TGF-β1和FN mRNA的表達(dá)。(2)觀察IL-13對(duì)體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞纖維化的作用：用不同濃度IL-13(1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞不同時(shí)間(24h、48h),ELISA法檢測(cè)細(xì)胞

7、上清TGF-β1和FN的水平,q-PCR檢測(cè)TGF-β1和FN mRNA的表達(dá)。(3)觀察IL-4、IL-13對(duì)高糖培養(yǎng)下人近端腎小管上皮細(xì)胞纖維化的作用：用IL-4(100ng/ml)、IL-13(1ng/ml)分別刺激高糖培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞48h,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清TGF-β1和FN的水平,q-PCR檢測(cè)TGF-β1和FN mRNA的表達(dá)。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件S

8、PSS17.0進(jìn)行分析,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較用LSD-t法,方差齊性檢驗(yàn)用于組內(nèi)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界定為P＜0.05。
　　結(jié)果：1.與正常組相比較,DM組與DKD組外周血PBMC中ILC2比例顯著升高,且DKD組升高比DM組更為顯著,其中DKD2組又高于DKD1組(P＜0.05)。2.DM組與DKD組血漿中細(xì)胞因子IL-4、IL-5及IL-13的水平較正常組明顯升高,且DKD組升高比DM

9、組更為顯著,DKD2組高于DKD1組(P＜0.05)。3.與正常組相比較,IL-4可呈濃度及時(shí)間依賴性促進(jìn)體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、FN的mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。4.與正常組相比,IL-13可以增強(qiáng)體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞FN和TGF-β1的表達(dá)(P＜0.05)。5.與高糖組相比,IL-4+高糖組和IL-13+高糖組的FN、TGF-β1的表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1.糖尿病腎病患者外周