伊洛前列素對(duì)2型固有淋巴細(xì)胞的作用研究.pdf

1、背景與目的:
　　過(guò)敏性哮喘是一種以肺部炎癥、氣道高反應(yīng)性、粘液分泌過(guò)多和氣道重塑為特征的復(fù)雜的呼吸道異質(zhì)性疾病。在過(guò)敏性哮喘中，ILC2s在2型免疫反應(yīng)的起始和進(jìn)展階段起到了十分關(guān)鍵的促進(jìn)作用。當(dāng)呼吸道受到抗原、寄生蟲(chóng)或病毒的刺激之后，受損的氣道上皮細(xì)胞可以分泌IL-33、IL-25以及TSLP等“警報(bào)素”，這些細(xì)胞因子能夠激活I(lǐng)LC2s產(chǎn)生IL-5、IL-13、IL-9等Th2型細(xì)胞因子，促使肺部嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，氣道黏液的

2、分泌和氣道平滑肌收縮。此外，ILC2s可以協(xié)調(diào)細(xì)胞反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，與多種類(lèi)型的免疫細(xì)胞進(jìn)行交互作用，促使肺損傷炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)。
　　Friedrich C.Luft等人通過(guò)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，具有血栓素抑制特性的COX產(chǎn)物可以改善哮喘模型小鼠的哮喘癥狀，即COX產(chǎn)物能夠抑制過(guò)敏原誘導(dǎo)的過(guò)敏性炎癥反應(yīng);PGI2是花生四烯酸經(jīng)COX途徑的代謝產(chǎn)物，在肺部的來(lái)源主要是是血管內(nèi)皮細(xì)胞，可通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體IP發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。PGI2類(lèi)似物伊洛前列

3、素在臨床一直被應(yīng)用于治療肺動(dòng)脈高壓;伊洛前列素作為COX產(chǎn)物類(lèi)似物的一種，它是否可以擴(kuò)展應(yīng)用于過(guò)敏性氣道炎癥疾病的治療？直到目前還未被認(rèn)證。本課題組通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伊洛前列素可以明顯減輕由IL-33誘導(dǎo)的氣道炎癥模型小鼠的肺部炎癥情況:如小氣道及血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)減輕，氣道黏膜上皮杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌減少，肺組織、BALF中嗜酸性粒細(xì)胞和ILC2s含量減少等炎癥減輕現(xiàn)象。初步證實(shí)了伊洛前列素能夠明顯改善肺部炎癥情況。
　　ILC2

4、s與Th2型細(xì)胞具有相似功能，在氣道炎癥發(fā)生的早期階段可受到“警報(bào)素”刺激，分泌大量Th2型細(xì)胞因子，被稱(chēng)作Th2的“鏡像細(xì)胞”，是過(guò)敏性氣道炎癥早期Th2型細(xì)胞因子的主要來(lái)源。由于課題組前期已經(jīng)在小鼠氣道炎癥模型中驗(yàn)證了伊洛前列素可以改善肺部及氣道炎癥情況，但還未有研究證實(shí)伊洛前列素可以抑制ILC2s的增殖及功能活化，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及查閱相關(guān)文獻(xiàn)我們推測(cè)伊洛前列素可以通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體IP，對(duì)ILC2s的功能也產(chǎn)生抑制作用，從而在炎癥

5、發(fā)生的早期發(fā)揮抑制炎癥的作用。為了從細(xì)胞水平及分子水平驗(yàn)證研究設(shè)想，本研究擬選用退役（半年以上）C57BL/6J小鼠肺組織中分離出的ILC2s，在體外探究伊洛前列素對(duì)ILC2s的增殖及其分泌IL-5、IL-13的能力的影響，為哮喘的治療提供新的治療依據(jù)。
　　方法:
　　1.體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn):選用6-8周雌性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為vehicle組、IL-33刺激組、IL-33+iloprost干預(yù)組、伊洛前列素對(duì)照組，采用

6、IL-33滴鼻法建立小鼠氣道炎癥模型，HE染色觀察肺組織中小氣道及血管周?chē)装Y浸潤(rùn)情況;PAS染色檢測(cè)氣道上皮杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌情況。
　　2.體外實(shí)驗(yàn):選取C57BL/6J退役雌鼠，密度梯度離心法結(jié)合磁珠分選法分離出肺組織中的Lineage淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分選出lineage-KLRG-1+Sca-1+細(xì)胞，即ILC2s。將分選得到的ILC2s分為vehicle、IL-33、IL-33+伊洛前列素和單獨(dú)伊洛前列素組。細(xì)胞

7、計(jì)數(shù)檢測(cè)不同組細(xì)胞數(shù);IC檢測(cè)ILC2s內(nèi)Ki-67、GATA3、STAT5表達(dá)情況;
　　3.分子實(shí)驗(yàn):ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)72h后上清中IL-5、IL-13水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ILC2s中IL-5、IL-13、GATA3、PPARγ的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　一、體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.HE和PAS染色結(jié)果經(jīng)鼻滴入IL-33后，IL-33刺激組小鼠肺組織切片可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞

8、增生以及黏液分泌增加;使用伊洛前列素干預(yù)后小氣道及血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，氣道上皮杯狀細(xì)胞增生情況減輕，黏液分泌減少。
　　二、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)培養(yǎng)72h的ILC2s進(jìn)行分組計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-33刺激組（11170.41±2210.20個(gè)/孔）較vehicle（8334.46±2020.11個(gè)/孔）、單獨(dú)伊洛前列素組（6972.57±850.13個(gè)/孔）細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)，IL-33+伊

9、洛前列素干預(yù)組（6972.57±850.13個(gè)/孔）細(xì)胞數(shù)目則較IL-33組明顯減少(P＜0.05)。
　　2.IC結(jié)果對(duì)分組培養(yǎng)24h的ILC2s細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)染色，檢測(cè)核內(nèi)磷酸化蛋白pSTAT5水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-33組pSTAT5水平（MFI:4706.91±1343.11）明顯較vehicle組（MFI:2051.63±794.10）、單獨(dú)伊洛前列素組（MFI:2429.37±635.00）明顯升高，而IL-33+伊洛前列素

10、組pSTAT5水平(MFI:2706.01±579.29)較IL-33組明顯降低（P＜0.05）;對(duì)培養(yǎng)72h的ILC2s進(jìn)行胞內(nèi)染色檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子GATA3表達(dá)量，研究結(jié)果趨勢(shì)與pSTAT5檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相同;IL-33組GATA3水平(MFI:22120.60±5740.00)較vehicle組（MFI:14680.34±5631.11）、單獨(dú)伊洛前列素組（MFI:11503±3251.41）明顯升高(P＜0.05);而IL-33+伊洛

11、前列素組GATA3水平（MFI:10340.18±3293.21）較IL-33組明顯降低（P＜0.05）;胞內(nèi)染色檢測(cè)分組培養(yǎng)72h后ILC2s核內(nèi)Ki-67表達(dá)情況，結(jié)果顯示:IL-33組Ki-67+ILC2s百分比（68.28±9.45％）較vehicle組（54.48±7.43％）、單獨(dú)伊洛前列素組(50.36±5.83％)明顯升高（P＜0.05）;而IL-33+伊洛前列素組Ki-67+ILC2s百分比(46.22±15.81％)

12、較IL-33組明顯降低（P＜0.05）。
　　三、分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.ELISA結(jié)果ELISA檢測(cè)72h時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-33組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-5及IL-13水平（IL-5:397.00±53.57pg/mL，IL-13:284.85±36.92pg/mL）較vehicle組（IL-5:21.43±3.64pg/mL，IL-13:20.25±2.19pg/mL）、單獨(dú)伊洛前列素組（IL-5:23.05±4.

13、09pg/mL，IL-13:20.70±4.46pg/mL）有明顯升高(P＜0.05)，而IL-33+伊洛前列素組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-5及IL-13水平（IL-5:277.48±27.94,IL-13:19.90±3.44）較IL-33組明顯降低(P＜0.05)。
　　2.Real-time PCR結(jié)果IL-33刺激組ILC2s中IL-5（1.69±0.46）、IL-13(1.90±0.56)、GATA3（0.78±0.36）相對(duì)

14、表達(dá)量較vehicle組(1)和單獨(dú)伊洛組（IL-5:0.39±0.20，IL-13:0.18±0.12，GATA3:0.24±0.09）明顯上調(diào)（P＜0.05）;IL-33聯(lián)合伊洛前列素組中IL-5（0.71±0.39）、IL-13（1.01±0.71）、GATA3（0.11±0.08）mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P＜0.05);IL-33+伊洛前列素組（4.20±0.4）、單獨(dú)伊洛前列素組（1.89±0.38）PPAR gamma相