基于轉(zhuǎn)錄組的轉(zhuǎn)基因水稻安全評價研究.pdf

1、近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，作物抗蟲、抗病、抗逆等問題相繼得到有效控制。然而，轉(zhuǎn)基因生物(GMO，Genetically Modified Organisms)在轉(zhuǎn)入外源基因獲得目標性狀的同時，也可能會引起其他非預(yù)期效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性備受社會各界關(guān)注。目前為止，轉(zhuǎn)基因生物非預(yù)期效應(yīng)的研究大多數(shù)還停留在表型上的觀察，很少涉及到分子水平上的解析，因此，開展轉(zhuǎn)基因生物在分子水平上的非預(yù)期效應(yīng)研究很有必要。
　　本課題為了從轉(zhuǎn)

2、錄組水平對外源基因Cry1Ac、EPSPS在植物體內(nèi)表達而引起的非預(yù)期效應(yīng)進行安全性評價展開了一系列工作。我們選取非轉(zhuǎn)基因水稻秀水11，以秀水11為受體轉(zhuǎn)入耐草甘膦基因(EPSPS)的水稻家系P1417、P1418，轉(zhuǎn)入抗蟲耐草甘膦基因(Cry1Ac，EPSPS)的水稻家系P1411、P1415為實驗材料，在水稻的生長過程中對相關(guān)農(nóng)藝性狀進行調(diào)查、鑒定和統(tǒng)計，分析表型差異。同時利用TAIL-PCR技術(shù)和實時熒光PCR確定轉(zhuǎn)基因水稻中外源

3、基因的插入位點及拷貝數(shù);提取轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因水稻樣本RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序，并將得到的結(jié)果進行實驗驗證分析。
　　DNA分子驗證、蛋白試紙條以及體外噴施草甘膦實驗確定了P1411、P1415、P1417、P14184個轉(zhuǎn)基因水稻家系中均有外源基因的插入，其中P1417、P1418均轉(zhuǎn)入了耐草甘膦基因EPSPS，P1411、P1415均轉(zhuǎn)入了抗蟲和耐草甘膦基因(Cry1Ac，EPSPS)。利用TAIL-PCR技術(shù)分別獲得了4個轉(zhuǎn)基因水

4、稻家系外源基因插入的側(cè)翼序列，然后通過NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對獲得的側(cè)翼序列進行網(wǎng)上比對確定P1411、P1415、P1417、P14184個轉(zhuǎn)基因水稻家系外源基因插入位置分別是:chromosome3/OSJNBb0016P23、chromosome3/OSJNBa0004G17、chromosome12/OJ1388_B05/Os12g0616500、chromos

5、ome11/OSJNBa0058G18，并且利用實時熒光PCR技術(shù)確定了4個轉(zhuǎn)基因水稻的插入拷貝數(shù)均為1個拷貝。
　　轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，P1411、P1415共有的差異表達基因有14個，沒有共有的GO顯著富集通路和KEGG顯著富集通路;P1417、P1418共有的差異表達基因有20個，沒有GO顯著富集通路及KEGG顯著富集通路。4個轉(zhuǎn)基因家系共有的差異基因有3個，分別為EPSPS、EPlOSAG00000010309、OS07G

6、0504200。其中EPlOSAG00000010309為非編碼RNA且沒有GO富集通路及KEGG富集通路;OS07G0504200為編碼蛋白，有1個KEGG富集通路;EPSPS為外源目的基因，有43個GO富集通路，4個KEGG富集通路。差異表達基因的富集通路均不顯著。4個轉(zhuǎn)基因水稻家系鄰近基因的分析顯示，鄰近差異表達基因共有25個，且差異較小。對2個預(yù)期表達目的基因及2個非預(yù)期表達基因進行相對定量驗證，結(jié)果顯示這4個基因的表達均較穩(wěn)定

7、。
　　田間農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計結(jié)果顯示抗蟲耐草甘膦水稻P1411、P1415的抽穗期晚于非轉(zhuǎn)基因及耐草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻，這可能是P1411、P1415轉(zhuǎn)化體引起的特異性事件。而株高、分蘗數(shù)、百粒重等統(tǒng)計結(jié)果顯示相同轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因水稻沒有表現(xiàn)出一致的差異。
　　綜合轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果和田間農(nóng)藝性狀的考察，P1411、P1415、P1417、P14184個轉(zhuǎn)基因水稻家系轉(zhuǎn)入外源基因Cry1Ac和EPSPS后會引起非預(yù)期效應(yīng)，但相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體