CyclinD1、CDK4、P16及R6基因在砷誘發(fā)HaCaT細胞惡性轉變過程中的表達意義.pdf

1、目的:研究cyclin D1,CDK4,P16及Rb基因在砷誘發(fā)HaCaT細胞惡性轉變過程中的表達及意義。
　　 方法:應用低濃度砷劑(100nM)長期作用于HaCaT細胞20周,觀察細胞形態(tài)學改變,應用軟瓊脂克隆形成實驗觀察單克隆形成情況,應用Real Time-PCR檢測MMP-9表達水平,以構建砷致HaCaT細胞惡性表型細胞。應用Real Time-PCR檢測砷致HaCaT細胞惡性轉化過程中,不同時間點(0周,6周,15周

2、,20周)cyclinD1,CDK4,P16及Rb基因mRNA表達水平。
　　 結果:
　　 1.成功構建砷致HaCaT細胞惡性表型細胞
　　 砷劑長期低濃度(100nM)作用于HaCaT細胞20周,細胞顯示了形態(tài)學上的改變,即單個細胞邊界不清,形態(tài)多樣,伸展性差,細胞體積變小,頻繁出現(xiàn)多核巨細胞。軟瓊脂克隆形成實驗計算單克隆體形成率,砷劑組單克隆體形成率(0.67‰)明顯多于對照組(0.16‰)(P＜0.05)

3、。Real Time-PCR檢測顯示砷劑組(20周)基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)mRNA表達水平顯著高于對照組。
　　 2.CDK4/cyclinD1/p16/Rb通路中各基因mRNA水平表達改變
　　 (1)P16 mRNA表達水平:與正常對照組(0周)HaCaT細胞相比,砷劑組第6周,15周,20周HaCaT細胞P16 mRNA表達均顯著高于正常對照組(P＜0.05)。P16mRNA最高表達水平出現(xiàn)于第6周,于1

4、5周,20周明顯回落。
　　 (2)Rb mRNA表達水平:與正常對照組(0周)HaCaT細胞相比,砷劑組第6周,15周,20周HaCaT細胞Rb mRNA表達均顯著高于正常對照組(P＜0.05)。Rb mRNA最高表達水平出現(xiàn)于第6周,于15周,20周Rb mRNA表達水平回落,但仍顯著高于正常對照組(P＜0.003,P＜0.004)。
　　 (3)CDK4 mRNA表達水平:與正常對照組(0周)HaCaT細胞相比,砷

5、劑組第6周,15周,20周HaCaT細胞CDK4 mRNA表達均顯著高于正常對照組(P＜0.05)。CDK4 mRNA表達于第6周出現(xiàn)顯著高水平表達,于第15周CDK4 mRNA表達回落,但與正常對照組(0周)相比,仍顯著升高(P＜0.009)。于第20周CDK4 mRNA表達又回升,且高于第6周CDK4 mRNA表達。
　　 (4)cyelin D1 mRNA表達水平:與正常對照組(0周)HaCaT細胞相比,砷劑組第6周,15

6、周,20周HaCaT細胞cyclin D1 mRNA表達均顯著高于正常組(P＜0.05)。Cyelin D1 mRNA最高表達水平出現(xiàn)于第6周,于第15周cyclin D1 mRNA表達回落,但仍顯著高于正常組(0周)(P＜0.007)。第20周cyclin D1 mRNA表達又略有上升。
　　 結論:
　　 1.應用低濃度砷劑長期作用于HaCaT細胞20周即可發(fā)生惡性轉化。細胞形態(tài)學上改變?yōu)閱蝹€細胞邊界不清,形態(tài)多樣,

7、伸展性差,細胞體積變小,頻繁出現(xiàn)多核巨細胞。軟瓊脂實驗單克隆體形成增多。MMP-9表達顯著增高。
　　 2.細胞周期調控p16-cyclin D1/CDK4-pRb途徑在砷誘發(fā)人類皮膚癌過程中發(fā)生異常。
　　 3.砷誘發(fā)HaCaT細胞惡性轉變過程中,在早期P16,cyclin D1,CDK4,Rb mRNA水平表達即顯著升高,提示p16-cyclin D1/CDK4-pRb途徑各相關基因mRNA水平改變是一早期分子事件。