CyclinD1、CDK4、P16及R6基因在砷誘發(fā)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中的表達(dá)意義.pdf

1、目的:研究cyclin D1,CDK4,P16及Rb基因在砷誘發(fā)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中的表達(dá)及意義。
　　 方法:應(yīng)用低濃度砷劑(100nM)長(zhǎng)期作用于HaCaT細(xì)胞20周,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,應(yīng)用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察單克隆形成情況,應(yīng)用Real Time-PCR檢測(cè)MMP-9表達(dá)水平,以構(gòu)建砷致HaCaT細(xì)胞惡性表型細(xì)胞。應(yīng)用Real Time-PCR檢測(cè)砷致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中,不同時(shí)間點(diǎn)(0周,6周,15周

2、,20周)cyclinD1,CDK4,P16及Rb基因mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建砷致HaCaT細(xì)胞惡性表型細(xì)胞
　　 砷劑長(zhǎng)期低濃度(100nM)作用于HaCaT細(xì)胞20周,細(xì)胞顯示了形態(tài)學(xué)上的改變,即單個(gè)細(xì)胞邊界不清,形態(tài)多樣,伸展性差,細(xì)胞體積變小,頻繁出現(xiàn)多核巨細(xì)胞。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算單克隆體形成率,砷劑組單克隆體形成率(0.67‰)明顯多于對(duì)照組(0.16‰)(P＜0.05)

3、。Real Time-PCR檢測(cè)顯示砷劑組(20周)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。
　　 2.CDK4/cyclinD1/p16/Rb通路中各基因mRNA水平表達(dá)改變
　　 (1)P16 mRNA表達(dá)水平:與正常對(duì)照組(0周)HaCaT細(xì)胞相比,砷劑組第6周,15周,20周HaCaT細(xì)胞P16 mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。P16mRNA最高表達(dá)水平出現(xiàn)于第6周,于1

4、5周,20周明顯回落。
　　 (2)Rb mRNA表達(dá)水平:與正常對(duì)照組(0周)HaCaT細(xì)胞相比,砷劑組第6周,15周,20周HaCaT細(xì)胞Rb mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。Rb mRNA最高表達(dá)水平出現(xiàn)于第6周,于15周,20周Rb mRNA表達(dá)水平回落,但仍顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.003,P＜0.004)。
　　 (3)CDK4 mRNA表達(dá)水平:與正常對(duì)照組(0周)HaCaT細(xì)胞相比,砷

5、劑組第6周,15周,20周HaCaT細(xì)胞CDK4 mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。CDK4 mRNA表達(dá)于第6周出現(xiàn)顯著高水平表達(dá),于第15周CDK4 mRNA表達(dá)回落,但與正常對(duì)照組(0周)相比,仍顯著升高(P＜0.009)。于第20周CDK4 mRNA表達(dá)又回升,且高于第6周CDK4 mRNA表達(dá)。
　　 (4)cyelin D1 mRNA表達(dá)水平:與正常對(duì)照組(0周)HaCaT細(xì)胞相比,砷劑組第6周,15

6、周,20周HaCaT細(xì)胞cyclin D1 mRNA表達(dá)均顯著高于正常組(P＜0.05)。Cyelin D1 mRNA最高表達(dá)水平出現(xiàn)于第6周,于第15周cyclin D1 mRNA表達(dá)回落,但仍顯著高于正常組(0周)(P＜0.007)。第20周cyclin D1 mRNA表達(dá)又略有上升。
　　 結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用低濃度砷劑長(zhǎng)期作用于HaCaT細(xì)胞20周即可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。細(xì)胞形態(tài)學(xué)上改變?yōu)閱蝹€(gè)細(xì)胞邊界不清,形態(tài)多樣,

7、伸展性差,細(xì)胞體積變小,頻繁出現(xiàn)多核巨細(xì)胞。軟瓊脂實(shí)驗(yàn)單克隆體形成增多。MMP-9表達(dá)顯著增高。
　　 2.細(xì)胞周期調(diào)控p16-cyclin D1/CDK4-pRb途徑在砷誘發(fā)人類皮膚癌過(guò)程中發(fā)生異常。
　　 3.砷誘發(fā)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中,在早期P16,cyclin D1,CDK4,Rb mRNA水平表達(dá)即顯著升高,提示p16-cyclin D1/CDK4-pRb途徑各相關(guān)基因mRNA水平改變是一早期分子事件。