紫鉚花素對(duì)大鼠急性脊髓損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 脊髓損傷嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，目前尚無(wú)有效的治療手段。脊髓損傷分為原發(fā)性和繼發(fā)性損傷。早期中斷繼發(fā)性損傷，可以改善脊髓組織的生存狀況，為功能恢復(fù)保存必需的解剖結(jié)構(gòu)，這代表了脊髓損傷治療的一種潛在方向。炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的主要成分，在急性脊髓損傷的病理生理學(xué)機(jī)制中處于中心地位。脊髓損傷后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)和凋亡在脊髓損傷后的神經(jīng)功能的恢復(fù)中具有重要作用。紫鉚花素是從傳統(tǒng)中草藥錦雞兒中提取的主要活性成分，作為一種植物源性多

2、酚類(lèi)化合物，紫鉚花素具有抗氧化、抗炎癥等多種藥理作用。紫鉚花素是IKKβ的選擇性抑制劑，可有效抑制NF-κ B的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。最近的研究表明，紫鉚花素可以減少炎癥基因表達(dá)從而保護(hù)小鼠海馬神經(jīng)元，但其在脊髓損傷中的作用效果尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬建立大鼠急性脊髓損傷模型，采用硬膜下給藥方式注射紫鉚花素，通過(guò)對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)，組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞凋亡情況，趨化因子、及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及IKK/NF-κB信號(hào)通路激活情

3、況的觀察，了解紫鉚花素對(duì)脊髓損傷的治療作用及其分子生物學(xué)機(jī)制，為紫鉚花素在脊髓損傷中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)。
　　 方法:
　　 1、健康成年雌性SD大鼠，應(yīng)用改良Allen法建立大鼠中度脊髓損傷模型，損傷位置在胸12椎體，損傷能量為25g*cm。
　　 2、將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成3組，分別為假手術(shù)組（僅切除椎板，不損傷脊髓），脊髓損傷組（損傷脊髓，給予1％的DMSO，50μ1/公斤體重）和紫鉚花素治療組（損傷脊髓

4、，給予紫鉚花素0.5mg/公斤體重）。
　　 3、給藥方式:脊髓損傷后15分鐘在損傷脊髓下方0.5cm處硬膜下穿刺，將藥物或溶劑注射進(jìn)入硬膜下腔腦脊液中。
　　 4、觀測(cè)紫鉚花素對(duì)脊髓損傷后大鼠后肢神經(jīng)功恢復(fù)情況。在脊髓損傷后15分鐘硬膜下注入相應(yīng)藥物，應(yīng)用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)脊髓損傷后1、7、14、21天后肢運(yùn)動(dòng)功能，應(yīng)用CBS聯(lián)合評(píng)分對(duì)脊髓損傷后1、7、14、21天大鼠后肢的腳趾伸展、觸地反應(yīng)、回縮反射、矯正反射以及肢體動(dòng)

5、作協(xié)調(diào)等方面功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 5、觀測(cè)紫鉚花素對(duì)大鼠急性脊髓損傷24hr后炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞凋亡的影響。在脊髓損傷后15min硬膜下注入相應(yīng)藥物，在脊髓損傷后24hr處死動(dòng)物取1cm脊髓組織，應(yīng)用于/濕重比檢測(cè)組織水腫程度;應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫印跡分析檢測(cè)脊髓損傷后組織中iNOS和Bax的表達(dá);應(yīng)用免疫印跡分析脊髓損傷后組織MCP-1、Caspase-3蛋白表達(dá);應(yīng)用MPO活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脊髓標(biāo)本中MPO活性;應(yīng)用一步法

6、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脊髓損傷后組織中細(xì)胞凋亡的情況。
　　 6、觀測(cè)紫鉚花素對(duì)大鼠急性脊髓損傷后IKK/NF-κB信號(hào)通路的影響。在脊髓損傷后15分鐘硬膜下注入相應(yīng)藥物，在脊髓損傷后24小時(shí)處死動(dòng)物取1cm長(zhǎng)脊髓標(biāo)本，應(yīng)用光譜法定量檢測(cè)損傷脊髓組織中IKKβ激酶活性，采用蛋白免疫印跡檢測(cè)損傷脊髓組織中NF-κB及磷酸化I-κBα表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、BBB評(píng)分顯示:在脊髓損傷后第一天，脊髓損

7、傷組和紫鉚花素治療組均表現(xiàn)出嚴(yán)重的后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙，平均評(píng)分分別是1.2±0.25和1.1±0.14，與假手術(shù)組中的大鼠比較有顯著性差異(p＜0.01);在脊髓損傷后14天，脊髓損傷組和紫鉚花素治療組之間出現(xiàn)了顯著性差異(p＜0.05)，脊髓損傷組中的大鼠后肢僅僅顯示出恢復(fù)了三關(guān)節(jié)（髖、膝、踝）的運(yùn)動(dòng)，平均分為6.6±0.42;而紫鉚花素治療組中大鼠后肢則顯示出后肢足底處于負(fù)重位，可出現(xiàn)負(fù)重步行，平均得分為11.2±0.54。CBS評(píng)分

8、系統(tǒng)對(duì)脊髓損傷后大鼠后肢的感覺(jué)及神經(jīng)反射功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，在脊髓損傷后第一天，脊髓損傷組和紫鉚花素治療組均表現(xiàn)出嚴(yán)重的后肢感覺(jué)及神經(jīng)反射功能障礙，與假手術(shù)組中的大鼠比較有顯著性差異(p＜0.01。在損傷后21天，紫鉚花素治療組和脊髓損傷組之間存在顯著性差異(p＜0.05)。脊髓損傷組大鼠僅獲得相當(dāng)于假手術(shù)組23.4％的評(píng)分，而紫鉚花素治療組的評(píng)分明顯增加，達(dá)到假手術(shù)組52.7％。
　　 2、在脊髓損傷后24小時(shí)，損傷組中水腫程度和M

9、PO活性、MCP-1和iNOS的表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，紫鉚花素治療可以明顯抑制它們的升高;脊髓損傷后凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，紫鉚花素治療可以明顯減少脊髓組織中細(xì)胞的凋亡。Westem blot方法顯示:與假手術(shù)組中的大鼠相比較，脊髓損傷后大鼠脊髓中激活型caspase-3表達(dá)明顯增加，紫鉚花素治療可以明顯減少脊髓組織中激活型caspase-3的表達(dá);脊髓損傷后Bax表達(dá)明顯增加，紫鉚花素治療可以明顯減少脊髓組織中Bax的表達(dá)。

10、　　 3、在脊髓損傷后24小時(shí)，同假手術(shù)組中的大鼠相比較，脊髓損傷組大鼠脊髓組織中的IKKβ激酶活性明顯升高，為0.84±0.027單位/毫克，紫鉚花素治療可以明顯抑制損傷后脊髓組織中IKKβ激酶活性的增高，兩者有顯著性差異(P＜0.05)。在術(shù)后24小時(shí)，假手術(shù)組中有少量磷酸化I-κBα蛋白;脊髓損傷組磷酸化I-κBα蛋白明顯增高(P＜0.01);紫鉚花素干預(yù)可以明顯抑制磷酸化I-κBα蛋白表達(dá)的增高(P＜0.05);在脊髓損傷后2

11、4小時(shí)，與假手術(shù)組中大鼠相比較，脊髓損傷組中大鼠脊髓組織中NF-κB p65的表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，紫鉚花素治療可以明顯抑制脊髓組織中NF-κB p65的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、紫鉚花素改善急性脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)及神經(jīng)反射的恢復(fù)，表明其對(duì)脊髓損傷具有治療意義。
　　 2、傷后早期硬膜下注射紫鉚花素治療可以減輕急性脊髓損傷后的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脊髓水腫程度，減少脊髓組織內(nèi)的細(xì)胞