馬鈴薯E3泛素StPUB17靶標StKH17在晚疫病抗性中的功能研究.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是中國第四大糧食作物，生產(chǎn)過程中會受到多種病蟲害的危害，嚴重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。其中由卵菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)De Bary.)引起的晚疫病是危害最嚴重的病害。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)馬鈴薯U-box類E3泛素連接酶StPUB17可以正調(diào)控晚疫病的抗性。通過酵母篩庫得到一個互作蛋白為StKH17，是一個含有KH-domain的RNA結(jié)合蛋白，在本氏

2、煙中初步鑒定是一個抗性負調(diào)控因子。本研究旨在通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得超量和干涉StKH17馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株，驗證其在晚疫病抗性中的功能;以StKH17為誘餌通過酵母雙雜交篩庫篩選與其互作的靶標蛋白;獲得穩(wěn)定表達StKH17和myc融合蛋白轉(zhuǎn)基因株系，為下一步利用Chip-seq技術(shù)研究StKH17調(diào)控的RNA靶標打下基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1、構(gòu)建了StKH17超量表達和RNAi干涉載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得了2個超量表達和6

3、個干涉馬鈴薯株系;晚疫病菌接種鑒定表明，超量表達StKH17降低晚疫病抗性，而干涉StKH17增強晚疫病抗性，即StKH17負調(diào)控馬鈴薯晚疫病的抗性。
　　2、蛋白結(jié)構(gòu)分析表明StKH17具有2個保守的結(jié)構(gòu)域，一個為STAR-domain，另一個為KH-domain。酵母自激活和點對點互作驗證表明，StKH17與StPUB17的互作需要STAR-domain，缺失STAR-domain對于酵母自激活效應(yīng)沒有影響;而KH-domai

4、n對于酵母自激活效應(yīng)很重要，但其缺失對于StKH17與StPUB17的互作沒有影響。
　　3、以StKH17△128-261為誘餌從酵母文庫中篩選到3個候選互作蛋白，一個為StKH17自身，另一個為StKH17-2，還有一個為StKH17-3，酵母點對點互作驗證表明StKH17-2和StKH17-3與StKH17△128-261特異互作，而不與StPUB17互作。
　　4、構(gòu)建了破壞RNA結(jié)合能力的StKH17(GDDG)突

5、變體載體，在本氏煙中瞬時表達時，發(fā)現(xiàn)其不能促進晚疫病菌的侵染。表明GDDG domain對StKH17發(fā)揮功能十分重要。
　　5、構(gòu)建了StKH17-myc蛋白標簽載體并通過馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化，獲得11個轉(zhuǎn)基因株系，Western Blot檢測到了3個株系穩(wěn)定的表達了StKH17和3×myc融合蛋白。
　　本研究初步回答了StPUB17可能是通過降解負調(diào)控感病因子StKH17從而實現(xiàn)正調(diào)控馬鈴薯晚疫病抗性的假設(shè)。另外本研究結(jié)果表