流感病毒H5N1亞型虎源株的生物學(xué)特性及溯源.pdf

1、高致病性禽流感病毒為甲型流感病毒，主要在禽類中傳播。近年來(lái)不斷有人類感染高致病性禽流感并引起死亡的報(bào)導(dǎo)，也有其他物種如豬、犬、貓、虎、豹等感染的報(bào)導(dǎo)。該病毒的跨物種傳播引起了人們的廣泛關(guān)注。本試驗(yàn)分離到一株高致病性虎源流感毒株，研究了其生物學(xué)特性，并對(duì)其來(lái)源進(jìn)行了追溯。
　　1.流感病毒H5N1亞型虎源株的分離
　　某動(dòng)物園飼養(yǎng)的孟加拉國(guó)虎突然死亡，熒光PCR鑒定為流感病毒H5N1亞型，用SPF雞胚從該虎肺臟中分離到一株流感

2、病毒H5N1亞型，命名為A/Tiger/Jiangsu/1/2013。將采集的虎組織病料做病理切片，顯示肝臟的中央靜脈區(qū)有壞死灶，脾內(nèi)動(dòng)脈周圍淋巴鞘區(qū)域的淋巴細(xì)胞和邊上脾淋巴小結(jié)比較明顯稀少，肺臟的細(xì)支氣管內(nèi)有大量脫落的上皮細(xì)胞堵塞管腔。免疫組織化學(xué)切片顯示，肺泡內(nèi)有H5N1亞型流感病毒抗原存在，此為孟加拉虎感染H5N1高致病性禽流感病毒提供了組織學(xué)證據(jù)。
　　2.流感病毒H5N1亞型虎源株的核酸序列測(cè)定及致病性
　　虎源分

3、離株經(jīng)SPF雞胚純化，并測(cè)定其核酸序列。序列經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性最高的為2012年一個(gè)越南H5N1分離株:A/muscow duck/Vietnam/LBM/227/2012。測(cè)定純化后毒株的EID50，分別以101～106 EID50的稀釋度接種BALB/c小鼠，并測(cè)定出小鼠組織中的病毒滴度，發(fā)現(xiàn)在肺組織中病毒滴度最高，用Reed-Muench法計(jì)算病毒對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(MLD50)，結(jié)果顯示在第8天時(shí)接種不同滴度的所

4、有小鼠均已死亡，提示該毒株對(duì)小鼠的致病性極強(qiáng)。
　　3.虎源株的溯源樣本檢測(cè)
　　推測(cè)飼喂市售的光雞可能是導(dǎo)致該虎感染的原因，但光雞來(lái)源無(wú)從查找。課題協(xié)作單位對(duì)周邊12個(gè)地市的活禽交易市場(chǎng)和大型養(yǎng)禽場(chǎng)展開(kāi)流行病學(xué)調(diào)查，歷時(shí)一年，采集樣品1168份，樣品的種類包括肛拭、咽拭、洗禽污水、養(yǎng)殖飲水、糞便、裝禽的籠具和宰禽砧板拭子等。作者進(jìn)行了熒光PCR檢測(cè)，甲型流感病毒核酸陽(yáng)性的樣品進(jìn)而分離和純化病毒，二代測(cè)序技術(shù)測(cè)定其序列。PC

5、R檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性樣品總數(shù)為25例，其中常州和鎮(zhèn)江陽(yáng)性樣本數(shù)量最多，均為6例，陽(yáng)性率分別為3.8％和2.99％。最少的地區(qū)為淮安和泰州，均未能檢測(cè)到陽(yáng)性樣品;樣品總體平均陽(yáng)性率為1.8％。在所有樣品類型中宰殺禽類的砧板陽(yáng)性檢出率最高，為3.53％，其次是籠具表面的拭子，為3.18％，洗禽的污水陽(yáng)性率排列第三位，為3.09％，檢測(cè)率最低的是糞便，僅有1例，陽(yáng)性率為0.62％。25份陽(yáng)性樣品中共分離到流感毒株27株，有兩例樣品含有混合毒株。

6、27株流感病毒亞型分布為:1株H3N2，1株H5N1，2株H5N6，1株H6N6，3株H5N8亞型，10株H7N9和9株H9N2。所有的分離株用Illumina MiSeq測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行全基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用于毒株的遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和遺傳演化分析。
　　4.虎源株的遺傳學(xué)特性分析
　　構(gòu)建H5亞型毒株各基因片段的遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析H5亞型毒株各基因片段的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)H5N1亞型虎源株與2014年鎮(zhèn)江分離的H5N1亞型禽源株的7

7、個(gè)片段在遺傳進(jìn)化樹(shù)上始終在同一分支上;在各片段氨基酸序列比較上，二者的HA1和HA2斷裂位點(diǎn)的氨基酸序列均符合高致病性禽流感毒株的特征;在HA序列上適應(yīng)哺乳動(dòng)物受體的突變位點(diǎn)、HA和NA糖基化位點(diǎn)、NA耐藥性突變位點(diǎn)、宿主特異性位點(diǎn)及M1、M2、NS1、NS2、NP、PB1、PB2、PA等片段的致病性和耐藥性相關(guān)的突變位點(diǎn)二者也高度一致，這些分析結(jié)果證實(shí)，來(lái)自鎮(zhèn)江的H5N1亞型禽源株與H5N1亞型虎源株存在較高的遺傳演化關(guān)系，推測(cè)二者可

8、能來(lái)自同一親本。在流感病毒H5亞型分離株的進(jìn)化樹(shù)圖中還發(fā)現(xiàn)，虎源株的PB2片段與此次分離的流感病毒H5N8亞型南通株EV/Nantong/1029/2014(H5N8)和鎮(zhèn)江株EV/Zhenjiang/4342/2014(H5N8)在同一進(jìn)化支上，而非鎮(zhèn)江分離的H5N1亞型禽源株。這一結(jié)果提示，虎源株的PB2片段可能來(lái)自流感病毒H5N8亞型。
　　5.流感病毒H7N9與H9N2亞型毒株與H5亞型毒株內(nèi)部片段的比較
　　本試驗(yàn)

9、分析的毒株中，H7N9亞型毒株數(shù)量最多，占了全部分離株的三分之一以上;其次為H9N2亞型毒株，數(shù)量占三分之一。據(jù)報(bào)道，H7N9亞型流感毒株的內(nèi)部片段全部來(lái)自H9N2亞型。這些毒株與分離鑒定的虎源株出現(xiàn)的時(shí)間非常接近，因此有必要分析H7N9亞型、H9N2亞型及其H5亞型毒株基因片段的遺傳演化關(guān)系。結(jié)果顯示，H7N9與H9N2亞型毒株的內(nèi)部6個(gè)片段的遺傳進(jìn)化樹(shù)中，流感病毒不同亞型的片段卻在同一分支上，這一現(xiàn)象提示，H7N9亞型毒株的內(nèi)部片段