半乳糖基甘油酯的酶法合成及其抑菌活性研究.pdf

1、甘油糖酯廣泛存在于植物、動(dòng)物組織和微生物中，是植物葉綠體囊膜、細(xì)菌菌膜的重要組成成分，在化妝品、生物醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。甘油糖酯的生物活性中研究較多的主要有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等生物活性，對抑菌活性的研究較淺。目前合成甘油糖酯的方法主要是酶催化法。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，酶催化合成可以直接對底物進(jìn)行利用，反應(yīng)條件溫和，選擇性較高。本研究主要合成并分離制備出一系列酰基鏈長的半乳糖基甘油酯，探討了半乳糖基甘油酯的酶

2、催化合成工藝，并對半乳糖基甘油酯的抑菌活性進(jìn)行了研究。主要結(jié)果描述如下:
　　1.半乳糖基甘油酯的分離純化。以實(shí)驗(yàn)室自制的半乳糖基甘油和游離脂肪酸為原料，固定化脂肪酶Novozyme435為催化劑，在丙酮體系中合成了不同?；滈L（C10～C18∶2）的半乳糖基甘油酯。確定了半乳糖基甘油酯的TLC分析條件:半乳糖基甘油癸酸酯和脂酸酯的TLC展開體系為CH2Cl2∶CH3OH(9∶1，v/v)，半乳糖基甘油月桂酸酯、棕櫚酸酯和油酸酯的

3、TLC展開劑為CH2Cl2∶CH3OH(13∶1，v/v)，半乳糖基甘油亞油酸酯的TLC展開劑為CH2Cl2∶CH3OH(10∶1，v/v)。通過硅膠柱層析對半乳糖基甘油酯進(jìn)行分離純化:用氯仿平衡2-3個(gè)柱體積后上樣，用含體積比0.5％甲醇和0.05％乙酸的氟仿溶液洗脫過量的脂肪酸;隨后用一定比例的氯仿∶甲醇∶水（下層）洗脫并分管收集，得到半乳糖基甘油單酯及其二酯的純品;最后用甲醇洗脫未反應(yīng)的底物半乳糖基甘油。將分離出的12種半乳糖基甘

4、油酯通過HPLC-ELSD和MS進(jìn)行定性和定量分析，確定了分析不同半乳糖基甘油酯的流動(dòng)相條件。分析結(jié)果表明，上述半乳糖基甘油酯的純度均達(dá)到97％以上。
　　2.半乳糖基甘油棕櫚酸酯的合成及鑒定。通過單因素實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)溶劑、脂肪酶添加量、底物摩爾比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等影響脂肪酶催化合成半乳糖基甘油棕櫚酸酯的因素進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面方法，對三個(gè)影響較大的因素（酶添加量、底物摩爾比、反應(yīng)時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)化，響應(yīng)值為半乳糖基

5、甘油棕櫚酸酯產(chǎn)率，得到了最佳反應(yīng)條件:丙酮為溶劑，酶添加量為12.93 mg/mL，底物摩爾比（半乳糖基甘油∶棕櫚酸）為1∶4.49，55℃水浴反應(yīng)27.60 h時(shí)，半乳糖基甘油棕櫚酸酯的產(chǎn)率可達(dá)到90.17％，與模型預(yù)測值基本一致(90.18％)。最后通過NMR對半乳糖基甘油棕櫚酸單酯和二酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到半乳糖基甘油棕櫚酸單酯結(jié)構(gòu)為1-O-棕櫚?；?3-O-β-D-吡喃半乳糖基甘油和3-O-(6'-O-棕櫚?；?β-D-吡喃半乳糖

6、基)-sn-甘油兩種;二酯結(jié)構(gòu)為1-O-棕櫚?；?3-O-(6'-O-棕櫚酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-sn-甘油。
　　3.半乳糖基甘油月桂酸酯的合成及鑒定。對反應(yīng)溶劑、脂肪酶添加量、底物摩爾比、分子篩添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等影響酶催化合成半乳糖基甘油月桂酸酯的因素進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，得到了較為合理的反應(yīng)條件:以丙酮為反應(yīng)溶劑，固定化脂肪酶Novozyme435的添加量為30 mg/mL，底物摩爾比（半乳糖基甘油∶月桂酸）為1

7、∶12，分子篩添加量為58 mg/mL，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時(shí)間為24 h，此時(shí)半乳糖基甘油月桂酸酯產(chǎn)率為87.06％。之后，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對酶添加量、底物摩爾比和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了響應(yīng)曲面優(yōu)化，響應(yīng)值為半乳糖基甘油月桂酸酯產(chǎn)率，優(yōu)化得到了最佳反應(yīng)條件:當(dāng)酶添加量為24 mg/mL，底物摩爾比（半乳糖基甘油∶月桂酸）為1∶11.8，55℃水浴反應(yīng)25.24 h時(shí)，半乳糖基甘油月桂酸酯的產(chǎn)率可達(dá)到89.21％，模型預(yù)測值基本一致(89

8、.68％)，且與單因素優(yōu)化結(jié)果相比產(chǎn)率有所提高。最后通過NMR對半乳糖基甘油月桂酸單酯和二酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到半乳糖基甘油月桂酸單酯結(jié)構(gòu)為1-O-月桂?；?3-O-β-D-吡喃半乳糖基甘油和3-O-(6'-O-月桂?；?β-D-吡喃半乳糖基)-sn-甘油兩種;二酯結(jié)構(gòu)為1-O-月桂?；?3-O-(6'-O-月桂酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-sn-甘油。
　　4.半乳糖基甘油酯的抑菌效果研究。將半乳糖基甘油和之前合成的10種半乳糖基

9、甘油酯作用于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母，進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn);采用倍比稀釋法測定10種半乳糖基甘油酯的最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明:半乳糖基甘油沒有抗菌活性，半乳糖基甘油酯對食品常見的一些細(xì)菌均有一定的抗菌活性，對酵母和霉菌沒有抗菌活性。?；滈L度對半乳糖基甘油酯的抑菌活性影響較大，以中鏈脂肪酸為?；w時(shí)半乳糖基甘油酯的抑菌活性高于其他脂肪酸為?；w的半乳糖基甘油酯;酰基鏈長相同時(shí)，添加酰基鏈的不飽和度抑菌活性有所增大。