利用多重PCR和熒光定量PCR對(duì)羊肉進(jìn)行定性定量鑒定方法的建立.pdf

1、分類號(hào)：密級(jí)：S8131單位代碼：學(xué)號(hào)：100862012328利用多重PCR和熒光定量PCR對(duì)羊肉進(jìn)行定性定量鑒定方法的建立AnapproachfortheidentificationandquantificationofgoatandsheepmeatusingmultiplexPCRandRealtimePCR學(xué)位申請(qǐng)人：王思偉指導(dǎo)教師：張英杰教授學(xué)科專業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一

2、五年五月三十日摘要為了對(duì)羊肉進(jìn)行定性鑒別，本試驗(yàn)建立了一個(gè)多重PCR方法，可以一次性對(duì)山羊、綿羊、水貂、海貍鼠和鴨肉進(jìn)行鑒別。利用線粒體基因設(shè)計(jì)五對(duì)引物，使山羊、綿羊、水貂、海貍鼠和鴨的擴(kuò)增目的片段長度分別為577bp、265bp、23lbp、812bp和35lbp。通過特異性檢測，發(fā)現(xiàn)各物種引物僅能擴(kuò)增出相應(yīng)物種，其余物種均無擴(kuò)增結(jié)果；且引物和引物之間、模板和模板之間均無干擾現(xiàn)象。通過引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)，可確定各物種引物的比例為山羊：綿

3、羊：水貂：海貍鼠：鴨=3：5：4：2：3。通過退火溫度優(yōu)化試驗(yàn)，確定了多重PCR的最佳退火溫度為59℃。為了對(duì)羊肉進(jìn)行定量鑒別，本試驗(yàn)利用熒光定量Taqman探針法PCR，在線粒體Cytb基因上對(duì)山羊和綿羊設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并同時(shí)在16SrRNA基因上設(shè)計(jì)內(nèi)參引物和探針，對(duì)山羊和綿羊在混合肉樣中的含量進(jìn)行測定。本試驗(yàn)用DNA含量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)各物種質(zhì)量與所提DNA含量的關(guān)系(D值)進(jìn)行測量。通過對(duì)己知混合肉樣的測量，可知山羊肉含

4、量的平均相對(duì)誤差為682％，綿羊肉含量的平均相對(duì)誤差為814％。分別對(duì)多重PCR方法和熒光定量PCR方法進(jìn)行靈敏性檢測。試驗(yàn)證明，多重PCR反應(yīng)的DNA模板最低檢測限是O1ng，而熒光定量PCR方法的最低檢測限為001ng。兩種方法均能用于檢測經(jīng)高溫煮沸和高壓處理的肉樣。對(duì)多重PCR方法的待檢肉樣摻入不同比例的玉米粉，檢測結(jié)果無明顯影響。對(duì)含羊肉的混合肉樣進(jìn)行定性定量鑒定的方法步驟為：(1)提取模板DNA；(2)用多重PCR方法確定物種