基于納米材料和滾環(huán)擴增技術的生物傳感新方法的研究.pdf

1、酶、核酸及生物小分子等的活動在生命體中發(fā)揮著不可替代的作用，因此，快速、準確、實時的獲取這些生命活動信息對于生命體的研究以及疾病的臨床診斷和治療具有巨大的意義，生物傳感技術為這一需求提供了有力的手段。近年來，納米技術和核酸擴增技術等的發(fā)展為構建高靈敏度、高選擇性、快速高效的生物傳感器提供了全新的平臺，使生物傳感技術得到更廣泛的應用。本論文以microRNA、DNA甲基化修飾以及組蛋白去乙酰化酶為研究對象，結合納米材料和滾環(huán)擴增技術發(fā)展了

2、一系列新型的生物傳感器。具體內容包括:
　　microRNA在免疫細胞的分化發(fā)育、免疫應答的調控以及免疫系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮重要的作用，因此，研究單個細胞中microRNA的空間分布和表達水平對于考察microRNA及其調控網絡的復雜性在生物學中的作用具有十分重要的意義。在第2章中，我們開發(fā)了一種基于目標物觸發(fā)的等溫滾環(huán)擴增技術原位檢測腫瘤細胞microRNA的新方法。該方法首先利用改良的microRNA固定方法，將mi

3、croRNA的5'端磷酸基團與細胞中蛋白質的氨基通過EDC共價交聯(lián)，以降低microRNA在檢測過程中的損失。隨后以預先制備的DNA環(huán)探針與microRNA進行原位雜交，具有游離的3'末端的microRNA可以自身作為引物引發(fā)滾環(huán)擴增反應，在聚合酶的作用下產生與DNA環(huán)探針互補的含有microRNA序列的串聯(lián)重復序列。最后，利用熒光檢測探針對擴增產物進行識別，即可達到高靈敏度、高選擇性的檢測microRNA的目的。由于滾環(huán)擴增反應只能由

4、microRNA游離的3'末端觸發(fā)，因此從根本上消除了mRNA以及microRNA前體的干擾。我們使用這種方法實現了人肝癌細胞SMMC-7721和人正常細胞L02中miR-222與miR-223表達水平的高靈敏可視化檢測，并進一步實現了單個細胞中不同microRNA的同時檢測。
　　DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一個重要組成部分，其可通過影響DNA構象、穩(wěn)定性以及與蛋白質相互作用方式等途徑實現對基因表達的調節(jié)，目前已成為多種腫瘤診斷

5、的生物標志物。在第3章中，我們將滾環(huán)擴增技術與DNA為模板合成銀納米簇相結合，發(fā)展了一種可進行多組分DNA甲基化檢測的方法。該方法首先將DNA經過亞硫酸鹽處理產生堿基差異后與掛鎖探針雜交，再利用E.coliDNA連接酶對錯配堿基的高特異性識別使與帶有甲基化修飾的目標DNA完全互補的掛鎖探針連接成環(huán)形。隨后，以銀納米簇DNA模板作為引物，在具有強鏈置換能力的DNA聚合酶作用下啟動滾環(huán)擴增反應，產生環(huán)形探針的重復互補串聯(lián)序列。另外，擴增產物

6、的莖桿區(qū)域帶有HhaI內切酶的識別位點，可在酶的作用下釋放出大量可以合成銀納米簇的DNA模板。在硝酸銀、硼氫化鈉的作用下，產生熒光信號，從而實現目標DNA甲基化的檢測。該方法設計巧妙新穎，具有很好的靈敏度和選擇性，檢測限達6.4fM。
　　組蛋白去乙?；竻⑴c了腫瘤細胞生長、增殖與表達調控等諸多過程，且在癌細胞中高表達，使組蛋白處于低乙?；臓顟B(tài)，抑制多種抑癌蛋白及凋亡分化相關基因的表達，目前已成為腫瘤治療的靶點而日益引起學術界的

7、重視。在第4章中，我們以組蛋白去乙酰化酶1為模型分析對象，建立了一種基于氧化石墨烯平臺的組蛋白去乙?；笝z測新方法。在該方法中，使用了具有兩部分功能的多肽序列，一部分序列能夠通過π-π堆積作用吸附在氧化石墨烯表面，使氧化石墨烯與熒光基團之間發(fā)生熒光共振能量轉移從而淬滅熒光基團的熒光;另一部分序列則包含熒光基團及組蛋白去乙酰化酶作用的賴氨酸乙?；稽c。利用胰蛋白酶對組蛋白去乙?；缸饔煤蟮馁嚢彼徇M行識別和切割，可使熒光基團游離，從而避免被