羰基還原酶的半理性設(shè)計(jì)及其催化合成孟魯司特鈉-依折麥布中間體.pdf

1、孟魯司特鈉是治療哮喘的白三烯受體拮抗劑代表藥物，依折麥布是一種膽固醇吸收抑制劑，都具有良好的市場(chǎng)前景。近年來(lái)，利用生物催化劑不對(duì)稱還原前體酮合成手性醇成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本文利用計(jì)算機(jī)模擬確定突變位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上對(duì)一種對(duì)孟魯司特鈉手性中間體前體酮具有還原活性的羰基還原酶的改造進(jìn)行了研究;發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌對(duì)依折麥布手性醇具有不對(duì)稱還原合成活性。主要工作如下:
　　將對(duì)孟魯司特鈉手性中間體前體酮的具有還原活性的羰基還原酶(kred)基

2、因連接到pET22b質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒中，分別在大腸桿菌和畢赤酵母GS115進(jìn)行蛋白表達(dá)，使用粗酶液作為生物催化劑不對(duì)稱還原合成(S，E)-2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯與(S，E)-1-[3-[2-（7-氯-2-喹啉基）乙烯基]苯基]-3-[2-[2-羥基-2-基]苯基]丙-1-醇（孟魯司特鈉的兩個(gè)手性中間體），目標(biāo)產(chǎn)物ee值＞99％。
　　對(duì)kred進(jìn)行同源建模(swiss-m

3、odel)，應(yīng)用Discovery Studio2.5完成受體配體對(duì)接。分析輔酶及底物結(jié)合口袋，基于結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析，對(duì)酶分子進(jìn)行定點(diǎn)突變。發(fā)現(xiàn)209位點(diǎn)突變后，酶活提高了1.2倍。pET22b-kred(R209A)大腸桿菌重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白對(duì)2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯的活性是對(duì)2-[3-[3-[2-（7-氯喹啉）乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯基-2-丙醇活性1.35倍，應(yīng)用Disco

4、very studio模擬突變酶與兩種底物的對(duì)接并計(jì)算能量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶與前者對(duì)接后能量較小，模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
　　發(fā)現(xiàn)大腸桿菌全細(xì)胞作為生物催化劑對(duì)依折麥布手性中間體前體酮具有不對(duì)稱還原活性，產(chǎn)物(4S)-3-[(5S)-5-（4-氟苯基）-5-羥基戊?；鵠-4-苯基-1，3-氧氮雜環(huán)戊烷-2-酮ee值為99.99％，轉(zhuǎn)化率為70％。對(duì)此全細(xì)胞反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳反應(yīng)溫度為35℃，最佳反應(yīng)的pH值為7，1m