缺氧誘導(dǎo)因子-1a在人關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)及轉(zhuǎn)染HIF-1a后滑膜細(xì)胞功能及形態(tài)研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎是目前骨科中年以上人群中最常見的疾病之一,約10％以上大于45歲的人群受骨關(guān)節(jié)炎影響,60歲以上人群患病率高達(dá)50％,并且患病人數(shù)隨著年齡的增加逐步增多。其主要好發(fā)于負(fù)重大,活動(dòng)較多的關(guān)節(jié),以膝關(guān)節(jié)最為常見。臨床上骨關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛及壓痛、關(guān)節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)腫大、骨擦音、關(guān)節(jié)無(wú)力及活動(dòng)障礙等等。有研究顯示超過80％以上患者都伴有不同程度的日?；顒?dòng)受限,致殘率高達(dá)53％。其中一部分為原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎,另一部分為繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎,即

2、因膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、炎癥、關(guān)節(jié)不穩(wěn)、慢性反復(fù)的積累性損傷引起。原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的病因未明,目前大量研究表明其與年齡、肥胖、遺傳、免疫反應(yīng)、生物力學(xué)改變、關(guān)節(jié)腔內(nèi)細(xì)胞與基質(zhì)代謝平衡等因素有關(guān)。近年來,隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的迅速發(fā)展,以及對(duì)細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的深入研究,生物因素尤其是軟骨及滑液代謝介質(zhì)的研究越來越受到重視。關(guān)節(jié)軟骨中,軟骨細(xì)胞在基質(zhì)的合成與分解代謝中起到重要作用,而軟骨結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定依賴軟骨組織與蛋白多糖形成的基質(zhì)的平衡。當(dāng)關(guān)節(jié)微

3、環(huán)境改變后,軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)異常,導(dǎo)致軟骨結(jié)構(gòu)破壞,在機(jī)械應(yīng)力等的作用下,軟骨脫落、壞死,導(dǎo)致軟骨下骨硬化及囊性變,最終導(dǎo)致周圍骨贅增生,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞。
　　 眾所周知,關(guān)節(jié)腔內(nèi)是一個(gè)低氧環(huán)境,早期有研究表明正常人關(guān)節(jié)腔滑液中的氧含量為50-60mmHg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他正常組織。關(guān)節(jié)軟骨屬于無(wú)血管組織,其中的氧濃度較滑液中更低,有研究顯示表層軟骨細(xì)胞周圍氧濃度約為6-10％,而深層軟骨細(xì)胞周圍氧濃度僅為1-6％。軟骨細(xì)胞主要依靠從

4、滑液及軟骨下骨中獲得營(yíng)養(yǎng)及氧分,正常軟骨細(xì)胞中的ATP有75％來源于厭氧代謝,以適應(yīng)關(guān)節(jié)內(nèi)低氧環(huán)境。因此,關(guān)節(jié)腔內(nèi)氧代謝平衡對(duì)于維持關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用。大多數(shù)哺乳細(xì)胞具有氧感應(yīng)系統(tǒng),他們依靠上調(diào)一系列基因來維持細(xì)胞氧代謝平衡,這些因子包括紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A)、誘導(dǎo)型氮氧化物合成酶(iNOS)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶、葡萄糖分解代謝酶、廋素等等,其中在低氧環(huán)境中起最主要調(diào)節(jié)作用的是缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-

5、1)。
　　 缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor,HIF-1)是在研究缺氧誘導(dǎo)的促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白。它是由HIF-1α和HIF—1β構(gòu)成的異源二聚體,HIF-1α屬于bHLH-PAS蛋白家族中的一員,它是HIF-1調(diào)節(jié)缺氧中特有的調(diào)控亞基。既往大量研究顯示HIF—1在腫瘤發(fā)生、炎癥、缺血性組織及生長(zhǎng)板軟骨發(fā)育過程中具有重要作用。目

6、前有研究表明機(jī)體中HIF-1表達(dá)增高可以促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A)、誘導(dǎo)型氮氧化物合成酶(iNOS)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶、葡萄糖分解代謝酶、度素等基因的表達(dá),從而調(diào)節(jié)機(jī)體代謝方式。在骨關(guān)節(jié)研究中,早期發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中有HIF-1mRNA表達(dá),隨后在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中發(fā)現(xiàn)有HIF-1α蛋白表達(dá)的增高。然而,對(duì)其在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的具體作用仍不太明確。
　　 近年來,滑膜炎在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中的作用越來越受到

7、重視,大量研究顯示其在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。有研究表明骨關(guān)節(jié)炎中滑膜增殖與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中具有相似之處,同時(shí)大量研究者從關(guān)節(jié)鏡、核磁共振、彩超及分子生物學(xué)等方面研究了滑膜炎在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用,認(rèn)為滑膜炎在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程扮演重要角色。當(dāng)滑膜增殖及關(guān)節(jié)軟骨退變形成后,缺氧進(jìn)一步加劇,使未退變的軟骨細(xì)胞更加難以抵抗惡劣的缺氧環(huán)境。但目前HIF-1α在關(guān)節(jié)滑膜病變中表達(dá)研究鮮有報(bào)道,并且對(duì)于其在細(xì)胞中抵抗缺氧的研究較少。<

8、br>　　 本研究利用免疫組化技術(shù)將不同疾病及正常人膝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行染色比較,了解不同疾病HIF-1α表達(dá)差異,及其與下游蛋白表達(dá)相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步明確其在疾病發(fā)展過程中可能的作用。提取人骨關(guān)節(jié)炎滑膜總RNA,利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),建立過表達(dá)HIF-1α質(zhì)粒載體及將購(gòu)買siRNAHIF-1α載體轉(zhuǎn)染正常人滑膜細(xì)胞,研究轉(zhuǎn)染HIF-1α對(duì)于缺氧培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài),以及在低氧條件下細(xì)胞增殖能力的影響,初步了解HIF-1α在細(xì)胞適應(yīng)低氧中的功能。

9、
　　 第一章:HIF-1α在人關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)研究
　　 目的:研究骨關(guān)節(jié)炎、慢性非特異性滑膜炎、急性創(chuàng)傷性滑膜炎患者及正常人膝關(guān)節(jié)滑膜組織HIF-1α、VEGF表達(dá)情況,分析相關(guān)關(guān)系,慢性非特異性患者滑膜及正常人滑膜CD34表達(dá)差異,了解HIF-1α在關(guān)節(jié)炎病變進(jìn)展中的作用。
　　 方法:分別取骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織30例；慢性非特異性滑膜炎滑膜組織45例；急性創(chuàng)傷性滑膜炎滑膜組織25例；正常人滑膜組織10例。制

10、作石蠟切片,分別采用HE及免疫組化方法對(duì)所取標(biāo)本分別行HIF-1α、VEGF染色,正常滑膜及慢性非特異性滑膜炎滑膜行CD34染色,了解它們?cè)诟鹘M滑膜炎中表達(dá)情況,比較表達(dá)差異及HIF-1α與VEGF的相互關(guān)系。
　　 結(jié)果:HIF—1α及VEGF在正常人滑膜中幾乎未見陽(yáng)性表達(dá),急性創(chuàng)傷性滑膜炎組陽(yáng)性表達(dá)率分別為60％、48％,骨關(guān)節(jié)炎組陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.7％、80％,慢性非特異性滑膜炎組陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.9％、80％。H

11、IF-1α在各滑膜炎組表達(dá)率有差異(x2=25.481,P=0.000),骨關(guān)節(jié)炎組與慢性非特異性滑膜炎組無(wú)顯著差異(P=0.136),但均較急性創(chuàng)傷性滑膜炎組為高,差異具有顯著性(P=0.000)；VEGF表達(dá)率在在各滑膜炎組表達(dá)率有差異(x2=29.333,P=0.000),骨關(guān)節(jié)炎組、慢性非特異性滑膜炎組均較急性創(chuàng)傷性滑膜炎組表達(dá)率高,差異具有顯著性(P=0.000)。采用Sperman等級(jí)相關(guān)分析顯示HIF-1α與VEGF在急性

12、創(chuàng)傷性滑膜炎組、慢性非特異性滑膜炎組、骨關(guān)節(jié)炎組均成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.596、0.525、0.600。MVD(CD34染色陽(yáng)性)在慢性滑膜炎組表達(dá)較正常組高,且HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)患者滑膜組織中MVD較陰性者高。
　　 結(jié)論:骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中HIF-1α及 VEGF表達(dá)顯著增高,它們可能在關(guān)節(jié)退變過程中具有重要作用；關(guān)節(jié)在退變、炎癥、創(chuàng)傷時(shí),滑膜組織均中有HIF—1α表達(dá)增高,且與VEGF有顯著相關(guān)性,說明其在滑膜

13、炎發(fā)展過程中具有促進(jìn)滑膜增殖的作用；HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)滑膜的MVD較陰性高,其在促進(jìn)血管增生方面具有重要作用。
　　 第二章:在人滑膜細(xì)胞(HS-4700細(xì)胞)轉(zhuǎn)染HIF-1α后細(xì)胞形態(tài)及功能研究
　　 目的:通過建立過表達(dá)HIF-1α質(zhì)粒載體,將過表達(dá)HIF-1α載體,HIF-1α干擾以及空載體分別轉(zhuǎn)染正常人滑膜細(xì)胞,在低氧下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的滑膜細(xì)胞,了解缺氧對(duì)于轉(zhuǎn)染后細(xì)胞功能及形態(tài)的影響。
　　 方法
　

14、　 ①分別于手術(shù)時(shí)獲取骨關(guān)節(jié)炎患者、急性創(chuàng)傷性滑膜炎患者、慢性非特異性滑膜炎及正常人滑膜組織,提取滑膜組織mRNA,利用RT-PCR檢測(cè)各組滑膜組織中HIF-1α及 VEGF基因表達(dá)情況。
　　 ②根據(jù)對(duì)應(yīng)的DNA模板設(shè)計(jì)原則,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段,并插入pcDNA3.0表達(dá)載體中,構(gòu)建過表達(dá)HIF-1α的HIF-1α/pcDNA3.0質(zhì)粒載體,并測(cè)序驗(yàn)證。
　　 ③將購(gòu)買的HIF-siRNA質(zhì)粒載體、空載體pcDNA

15、3.0及HIF-1α/pcDNA3.0質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染正常人滑膜細(xì)胞株(HS-4700),于低氧培養(yǎng)箱(含1％氧氣、5％二氧化碳、94％氮?dú)?中培養(yǎng)4小時(shí),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并利用Western Blot方法檢測(cè)不同滑膜細(xì)胞中HIF-1α含量。
　　 ④將轉(zhuǎn)染后的滑膜細(xì)胞置于含CoCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng),細(xì)胞平板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,了解HIF—1α對(duì)于細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 結(jié)果
　　 ①RT-PCR

16、結(jié)果顯示骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中HIF-1α及 VEGF基因表達(dá)明顯增高,急性創(chuàng)傷性滑膜炎及慢性非特異性滑膜炎組HIF-1α與VEGF基因表達(dá)增高,正?；ぶ形匆娒黠@表達(dá)。
　　 ②成功構(gòu)建HIF-1α/pcDNA3.0質(zhì)粒載體,經(jīng) DNA測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒中含有與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的HIF-1α中完全一致的DNA序列。
　　 ③成功將構(gòu)建的質(zhì)粒載體、空載體及購(gòu)買的siRNA HIF-1。轉(zhuǎn)染人滑膜細(xì)胞(HS-4700),經(jīng)缺氧培養(yǎng)后,過表達(dá)

17、HIF-1α滑膜細(xì)胞組形態(tài)無(wú)明顯改變,HIF-1α蛋白明顯增多,空載體轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞組輕度皺縮,缺氧后HIF-1α蛋白表達(dá)增高,siRNAHIF-1α轉(zhuǎn)染組明顯皺縮,未檢測(cè)到HIF-1α蛋白表達(dá)。
　　 ④三組細(xì)胞經(jīng)低氧下平板克隆實(shí)驗(yàn)后,HS/HIF-1α形成多量的細(xì)胞克隆,將細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)后經(jīng)單因素方差分析,HS/HIF-1α組較HS/mock和HS/siRNA HIF-Iα增殖能力顯著增高(F=195.852,P=0.000)。