NICD在不同分化胃癌組織中的表達及對胃癌細胞生物學影響.pdf

1、目的:
　　 1.研究Notch1胞內段NICD(Notch1 Intracellular Domain)在不同分化程度胃癌組織中的差異性表達。
　　 2.研究外源性NICD過表達對胃癌細胞株AGS的增殖、轉移以及化療敏感性的影響。
　　 方法:
　　 1.收集溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院2012年胃癌手術標本共12例。其中男性9例，女性3例，平均年齡66.25±11.86歲，其中高分化腺癌3例、中分化腺癌3例

2、，低分化腺癌3例及未分化腺癌3例。所有患者術前均未接受放療和化療。另取同期門診胃鏡室行活檢術取得的正常胃組織12例，其中男9例，女3例，平均年齡62.8±5.1歲。所有病例均獲得倫理審查委員會機構的倫理批準。所有標本均保存于液氮中。采用Western Blotting法檢測不同胃組織季正常胃組織中NICD的相對表達量。
　　 2.用陽離子脂質體lipofectamine2000將攜帶有NICD胞內段的真核表達質粒(pIERS2-

3、EGFP-NICD)轉入AGS細胞，并將轉入空質粒的AGS細胞作為陰性對照組，AGS細胞作為空白組。轉染24小時后，采用500μg/ml G418進行穩(wěn)定篩選，篩選二十天后半量(250μg/ml)維持培養(yǎng)。
　　 3.采用實時熒光定量PCR法檢測三組細胞Notch1信號通路相關基因的表達。采用Western blot檢測三組細胞NICD蛋白表達。
　　 4.采用CCK8法檢測三組細胞的細胞增殖，Transwell實驗檢測

4、三組細胞的侵襲能力，順鉑(DDP)、氟尿嘧啶（5-FU）檢測外源性NICD過表達對胃癌細胞化療敏感性的影響。
　　 5.統(tǒng)計學方法:采用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件進行分析，實驗結果采用均數(shù)加減標準差，顯著性采用單因素方差分析及t檢驗(P＜0.05)。
　　 結果:
　　 1.胃癌組織中，隨著分化程度的降低，NICD的表達逐漸升高（圖1A），正常胃粘膜組織NICD相對表達量為0.20±0.01;高分化胃癌組織NIC

5、D相對表達量為0.50±0.03;中分化胃癌組織NICD相對表達量為0.61±0.03;低分化胃癌組織NICD相對表達量為0.73±0.10;未分化胃癌組織NICD相對表達量為0.90±0.17(圖1B)。胃癌組較正常組表達量有統(tǒng)計學差異(p＜0.05, t=9.439)。
　　 2.轉染后熒光顯微鏡下觀察，實驗組細胞及陰性對照組細胞均帶有綠色熒光，空白對照組則無熒光。
　　 3.實時熒光定量PCR檢測，與陰性對照組細胞

6、、空白對照組細胞相比較，實驗組細胞下游基因Hes1、NF-κ B2mRNA表達明顯增加，而JAG1、notch1基因則無明顯變化。Western blot證實實驗組細胞NICD蛋白表達量明顯增加。
　　 4.實驗組細胞同對照組細胞相比，增殖率明顯升高;Transwell實驗表明，實驗組細胞穿過transwell小室數(shù)58.8±7.4，陰性對照組細胞22.6±3.17，空白對照組細胞23±2.86。實驗組細胞遷移能力高于對照組(P