基于高通量測(cè)序技術(shù)的藥用植物表達(dá)序列標(biāo)簽系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）技術(shù)是分離與克隆新基因、研究基因表達(dá)譜的有效方法。本研究利用EST分析方法，建立藥用植物轉(zhuǎn)錄組的研究方法體系，通過(guò)新一代高通量測(cè)序技術(shù)454 GS FLX Titanium獲得的ESTs，發(fā)掘藥用植物生物活性成分的合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因。本研究以甘草、丹參、蛇足石杉和龍骨馬尾杉為例，分析了高通量測(cè)序技術(shù)及轉(zhuǎn)錄組分析方法在藥用植物中的應(yīng)用。
　　 甘草（Glycyr

2、rhiza uralensis Fisch.ex DC.）是世界上使用最為廣泛的藥用植物之一，被廣泛應(yīng)用于食品和煙草添加劑。由于缺乏甘草的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，甘草酸生物合成途徑尚不明確。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)454 GS FLX Titanium對(duì)甘草的營(yíng)養(yǎng)器官的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建EST文庫(kù)。獲得59219條EST序列，平均長(zhǎng)度409 bp。將454測(cè)序所得EST與GenBank中50666條甘草EST進(jìn)行合并拼接，獲得27229條

3、unigene（11694條contig，15535條singleton）。將這些unigene與公共數(shù)據(jù)庫(kù)（SwissProt，KEGG，TAIR Nr和Nt）進(jìn)行比對(duì)注釋（閾值E≤1e-5），其中20229條序列獲得注釋，注釋結(jié)果大約包括10000獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄本。甘草酸骨架合成共涉及18個(gè)酶，在對(duì)EST文庫(kù)的分析整理中獲得了其中的16個(gè)酶的候選基因。本研究還發(fā)現(xiàn)了125個(gè)細(xì)胞色素P450候選基因和172個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶候選基因。根據(jù)CYP

4、家族，125個(gè)細(xì)胞色素P450候選基因被分為32類；根據(jù)GO基因功能分類，172個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶候選基因被分為45類。最后根據(jù)Real-time PCR器官特異性表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)最有可能參加甘草酸合成的基因，包括3個(gè)細(xì)胞色素P450和6個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶。
　　 丹參[Salvia miltiorrhiza Bge.）為唇形科（Labiatae）鼠尾草屬常用中藥，以根和根莖入藥?，F(xiàn)代化學(xué)及藥理學(xué)研究表明丹參含有兩類生理活性物質(zhì)：脂溶性的丹參

5、酮類化合物和水溶性的丹酚酸類化合物，目前丹參基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究較少。本研究應(yīng)用新一代高通量測(cè)序技術(shù)454 GS FLX Titanium對(duì)2年生丹參根的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，研究其基因表達(dá)譜，挖掘其功能基因。獲得46722表達(dá)序列標(biāo)簽（express sequence tags，EST），序列平均長(zhǎng)度414 bp，與Sanger測(cè)序的長(zhǎng)度相當(dāng)。所得序列與GenBank丹參EST合并拼接，獲得18235條unigene，其中，454高通量

6、測(cè)序發(fā)現(xiàn)了13980條新的unigene。數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列同源性比較表明，其中73.0％（13308條）與其他生物的已知基因具有不同程度的同源性。通過(guò)BLAST與GeneOntology分析獲得了可能參與丹參酮合成的序列27條（編碼15個(gè)關(guān)鍵酶），參與丹酚酸合成的序列29條（編碼11個(gè)關(guān)鍵酶），細(xì)胞色素P450序列70條，轉(zhuǎn)錄因子序列577條。
　　 石杉屬植物蛇足石杉（Huperzia serrata）和龍骨馬尾杉（Phlegm

7、ariuruscarinnatuas）均含有石松類生物堿-石杉?jí)A甲。石杉?jí)A甲是治療早老性癡呆癥新藥的主要成分，具有良好的應(yīng)用前景。雖然石杉科藥用植物具有重要的藥用價(jià)值，但是對(duì)于其基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究卻極為有限，嚴(yán)重制約了新藥的研發(fā)利用。在蛇足石杉和龍骨馬尾杉的454-EST數(shù)據(jù)中，分別獲得140930和79920條ESTs，拼接為36763和31812個(gè)轉(zhuǎn)錄本。其中，共注釋到115個(gè)蛇足石杉和98個(gè)龍骨馬尾杉的轉(zhuǎn)錄本與生物堿、萜類、黃酮

8、/類黃酮等化合物的生物合成相關(guān)。在蛇足石杉和龍骨馬尾杉中共同表達(dá)的CYP450s有63個(gè)，利用real-time PCR檢測(cè)了蛇足石杉中的編碼CYP450s的轉(zhuǎn)錄本在根和葉中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)轉(zhuǎn)錄本是在葉中高豐度表達(dá)而在根中表達(dá)較低。這與石杉?jí)A甲在蛇足石杉中的器官特異性分布即葉中含量最高、根中含量較低相一致。我們推測(cè)它們是參與石松堿生物合成的候選基因。此外，在蛇足石杉中發(fā)現(xiàn)2729個(gè)SSR位點(diǎn)，龍骨馬尾杉中發(fā)現(xiàn)1573個(gè)SSR位點(diǎn)

9、。
　　 454高通量測(cè)序技術(shù)作為藥用植物功能基因組研究的重要手段可在甘草、丹參、蛇足石杉和龍骨馬尾杉功能基因的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮重要作用。本研究獲得了重要藥用植物甘草、丹參、蛇足石杉和龍骨馬尾杉的大量ESTs，研究了它們的轉(zhuǎn)錄組信息，發(fā)現(xiàn)了許多可能參與次生代謝產(chǎn)物生物合成、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境響應(yīng)的基因。這將為鑒定參與有效成分生物合成的功能基因提供極為豐富的基因資源，近而為實(shí)現(xiàn)利用生物技術(shù)生產(chǎn)甘草酸、丹參酮、丹酚酸、石松堿奠定理論基