非諾貝特改善糖尿病小鼠傷口愈合的炎性機制.pdf

1、研究目的:
　　 傷口愈合能力受損是糖尿病患者面臨的一個重要臨床問題，并且是導致下肢截肢的首要原因。內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是循環(huán)的未成熟細胞，可以遷移到受損或缺血部位參與血管新生，在血管維護和血管新生方面起著重要的作用。由于上述原因，EPCs對傷口愈合的影響越來越受重視。傷口愈合與血管新生密切相關，近年來，血小板反應蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)

2、的抗血管生成的潛力已得到了確認。TSP-1 mRNA的表達在糖尿病EPCs內顯著升高。此外，TSP-1轉基因能降低微血管密度，減少巨噬細胞浸潤和下調IL-1β的表達。研究表明，高糖能夠誘導IL-1β在內皮細胞中合成。并且，葡萄糖誘導激活的硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)介導IL-1β mRNA的表達。TXNIP是高糖誘導下響應最高的上調蛋白。TXNIP是活性氧(reac

3、tive oxygen species，ROS)清除劑硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)的一種內源性抑制劑。氧化應激是多種疾病包括糖尿病并發(fā)癥細胞損傷的介質。這一過程還產生大量的超氧化陰離子O2，而O2生成增加又進一步加速了NO的滅活。非諾貝特干預降低糖尿病事件研究(fenofibrate intervention and eventlowering in diabetes，FIELD)指出:非諾貝特治療可以降低截肢風險，尤其

4、是降低沒有已知大血管疾病未成年人的截肢風險，這很可能是通過非降脂機制來進行調節(jié)的。由于皮膚傷口預后不良最終可能導致截肢，所以本課題對非諾貝特是否能夠改善糖尿病小鼠傷口愈合進行研究，圍繞炎癥介質(TSP-1、IL-1β、TXNIP、ROS等)探索其改善傷口愈合可能的炎性機制。
　　 研究內容及結果:
　　 1.非諾貝特改善糖尿病小鼠傷口愈合
　　 雄性C57BL/6小鼠隨機分為三組，即，對照組、鏈脲佐菌素(stre

5、ptozotocin，STZ)誘導糖尿病小鼠組和非諾貝特治療組（造模成功小鼠非諾貝特100mg/kg/d灌胃兩周）。在小鼠背部去除一塊直徑為6 mm的圓形皮膚，制造傷口模型。隔天拍照直至第12天并計算傷口面積。取第3、6、9天整個傷口皮膚制作石蠟切片進行CD31免疫組化檢查。結果顯示:糖尿病小鼠傷口愈合速度大幅下降，血管新生數目降低;非諾貝特治療的糖尿病小鼠傷口愈合速度明顯加快，血管新生數目增加。
　　 2.非諾貝特對糖尿病小鼠

6、EPCs數目和功能的影響
　　 采用流式細胞儀檢測小鼠外周血Sca-1和Flk-1雙標陽性的細胞比例，以檢測EPCs數目。采用改良的Boyden小室分析法測定EPCs遷移能力。將EPCs置于Matrigel上，檢測其小管新生能力。發(fā)現，糖尿病小鼠外周血EPCs數目明顯降低，BM-EPCs(Bone marrow EPCs)遷移和小管新生能力顯著下降;非諾貝特治療組外周血EPCs數目顯著增加，BM-EPCs遷移和小管新生能力顯著提

7、高。
　　 3.非諾貝特抑制糖尿病小鼠BM-EPCs內炎癥介質的表達
　　 利用Western Blotting的方法對小鼠BM-EPCs內的TSP-1和TXNIP進行檢測。采用流式細胞儀檢測BM-EPCs內NO和O2的含量。結果為:糖尿病小鼠BM-EPCs內TSP-1、TXNIP和O2-的含量明顯增加而NO的含量明顯降低;非諾貝特治療組BM-EPCs內TSP-1、TXNIP和O2-的含量明顯下降，NO的含量顯著升高。<

8、br>　　 4.非諾貝特抑制高糖誘導的BM-EPCs內炎癥介質的表達
　　 正常C57BL/6小鼠骨髓分離培養(yǎng)7天的EPCs，建立高糖(33 mmol/L葡萄糖)模型，分別給予非諾貝特1、5、10μmol/L處理，對BM-EPCs進行分析。結果顯示:高糖處理BM-EPCs的遷移和小管新生能力顯著降低，非諾貝特處理后能明顯抑制高糖對BM-EPCs遷移和小管新生的損傷作用。高糖處理BM-EPCs分泌的TSP-1和IL-Iβ明顯增多

9、，胞內TXNIP和O2-表達也明顯升高，NO的含量則顯著降低。非諾貝特處理后BM-EPCs TSP-1和IL-1β分泌量明顯下降，胞內TXNIP和O2表達也明顯降低，NO的含量明顯升高。給予PPAR-α(Peroxisome Proliferator-Activated Receptorα)拮抗劑MK886，非諾貝特仍能降低高糖刺激的IL-1β，說明非諾貝特產生的這種抗炎作用與其激動PPAR-α無關。
　　 結論: