5-羥色胺1A受體激動(dòng)劑高通量篩選模型的建立以及FABP4蛋白的結(jié)晶.pdf

1、第一部分5-羥色胺1A受體激動(dòng)劑高通量篩選模型的建立
　　 抑郁癥目前已成為世界第四大疾患，臨床表現(xiàn)為情緒低落、悲觀、睡眠障礙，嚴(yán)重者有自傷和自殺沖動(dòng)。中樞去甲腎上腺素、5-羥色胺、多巴胺等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量過(guò)低及其受體功能低下等都被認(rèn)為是引起抑郁癥的原因。目前，由于生活壓力日益增大以及一些家族基因遺傳，抑郁癥患者數(shù)量逐漸增多，這使得抑郁癥成為全球公共健康中的一大主要問(wèn)題。
　　 5-HT1A受體是5-HT受體家族中第一

2、個(gè)被克隆出來(lái)的亞型。人類遺傳學(xué)和圖像學(xué)研究表明5-HT1A受體與焦慮癥、抑郁癥、精神分裂癥等一系列精神疾病有關(guān)，目前臨床研究表明，其激動(dòng)劑能有效改善抑郁癥和焦慮癥。因此，開(kāi)發(fā)和尋找5-HT1A受體的激動(dòng)劑具有重要意義，而構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源5-HT1A受體是該受體激動(dòng)劑篩選的重要方法和手段。
　　 本文中為了尋找5-羥色胺1A(5-HT1A)受體的激動(dòng)劑，通過(guò)報(bào)告基因活性檢測(cè)的方法建立高通量篩選(HTS)細(xì)胞模型。首先將帶有人源5-

3、HT1A受體的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(pcDNA3.1-h5-HT1AR)與帶有報(bào)告基因pCRE-1uc的pcDNA3.1質(zhì)粒(pcDNA3.1-pCRE-1uc)共轉(zhuǎn)染到工具細(xì)胞中，通過(guò)對(duì)工具細(xì)胞的選擇、共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例、化合物孵育時(shí)間及陽(yáng)性化合物的選擇等條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，建立了一個(gè)可以穩(wěn)定表達(dá)人源5-HT1A受體并可用于該受體激動(dòng)劑篩選的細(xì)胞模型(HEK293-h5-HT1AR)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):根據(jù)瞬轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中信號(hào)值的高低，采

4、用HEK293細(xì)胞作為工具細(xì)胞;根據(jù)瞬轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中的信噪比，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-h5-HT1AR∶pcDNA3.1-pCRE-1uc的最佳比例為1:3;對(duì)化合物孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，選擇的最佳孵育時(shí)間為6小時(shí);陽(yáng)性化合物的選擇過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)研究了5-HT.HCl，F(xiàn)libanserin，8-OH-DPAT以及Lorcaserin(APD356)四個(gè)已報(bào)道有5-HT1A受體激動(dòng)活性的化合物，最后結(jié)果表明APD356在該體系中最適合作為陽(yáng)性化合

5、物?；谝陨蠗l件，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)5-HT1A受體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行12代的不定期檢測(cè)，信號(hào)基本維持穩(wěn)定。利用該模型，篩選了實(shí)驗(yàn)室的化合物，篩選到1個(gè)化合物，初步推測(cè)該化合物可能是5-HT1A受體的激動(dòng)劑。因此本實(shí)驗(yàn)所建立的模型可用于高通量5-HT1A激動(dòng)劑的篩選，對(duì)于抗抑郁藥的發(fā)現(xiàn)具有一定研究?jī)r(jià)值。
　　 第二部分脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白的結(jié)晶
　　 脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP4/AP2)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)

6、的脂肪酸結(jié)合蛋白，分布廣泛，在脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)較高。該基因的缺陷可以改善胰島素抵抗，并且可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化以及炎癥的發(fā)生，因此，F(xiàn)ABP4已成為治療糖尿病以及粥樣硬化的重要靶標(biāo)?；谝陨涎芯?jī)r(jià)值，研究人員積極尋找FABP4的新型小分子抑制劑。本實(shí)驗(yàn)室在體外篩選到系列FABP4靶標(biāo)抑制活性較高的化合物，希望進(jìn)一步了解其蛋白及小分子化合物的結(jié)合模式便于化合物的改造。本項(xiàng)研究主要借助大腸桿菌表達(dá)體系大量表達(dá)FABP4蛋白，并對(duì)該蛋白