晶狀體上皮細胞氧化損傷模型中酸性β—葡萄糖苷酶和鞘脂酶激活蛋白C的表達.pdf

1、多種因素共同作用導(dǎo)致白內(nèi)障形成，在此過程中幾個事件聯(lián)合起來共同誘導(dǎo)晶狀體一系列的病理生理學(xué)改變，包括晶狀體上皮細胞、纖維細胞膜成分和通透性改變、水電解質(zhì)紊亂、晶狀體蛋白質(zhì)翻譯后修飾及細胞凋亡途徑啟動等等，最終導(dǎo)致晶狀體混濁。動物的體內(nèi)及體外試驗和臨床研究有力顯示：氧化損傷的加重和白內(nèi)障的發(fā)展有關(guān)，在形成白內(nèi)障的反應(yīng)鏈中，一般認為氧自由基造成的損傷作為啟動因素觸發(fā)后續(xù)一系列反應(yīng)。本文針對體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞系HLE-B3細胞，用一定

2、濃度的過氧化氫(H2O2)作用于細胞構(gòu)建氧化損傷模型，然后以半定量RT-PCR和免疫細胞化學(xué)的方法檢測細胞中的酸性β-葡萄糖苷酶(GCase)和鞘脂酶激活蛋白C(SaposinC)的含量變化，旨在探討此兩種與晶狀體上皮細胞膜上脂質(zhì)構(gòu)成密切相關(guān)的物質(zhì)是否與氧化應(yīng)激過程相關(guān)，進一步探尋白內(nèi)障形成機制的線索。研究共分4部分，簡述如下。 第1部分H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞氧化損傷模型的建立目的：研究不同濃度H2O2對人晶狀體上皮細胞系

3、HLE-B3生長抑制及對細胞形態(tài)學(xué)的影響，確定體外氧化損傷模型適宜的H2O2濃度。 方法：H2O2設(shè)5個濃度梯度，分別為100，200，400，800和1600μM，作用于細胞24小時，用MTT法檢測不同濃度下細胞的抑制率。顯微鏡下觀察氧化應(yīng)激狀態(tài)下細胞的形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果：MTT法測得H2O2對HLE-B3細胞的半數(shù)抑制濃度為800μM。800μMH2O2處理使細胞增殖受抑制，細胞形態(tài)改變。 結(jié)論：H2O2抑制

4、人晶狀體上皮細胞系HLE-B3的增殖，抑制率呈現(xiàn)劑量依賴性；IC50為800μM。 第2部分半定量RT-PCR檢測GBA和Prosaposin在晶狀體上皮細胞系 的表達目的：研究體外培養(yǎng)的正常人晶狀體上皮細胞和氧化應(yīng)激下人晶狀體上皮細胞中GBA和Prosaposin基因在mRNA水平的表達情況。 方法：800μMH2O2分別作用于人晶狀體上皮細胞系HLE-B324，48，72小時。RT-PCR法檢測GBA和Pro

5、saposin基因在正常對照組和3個處理組中的表達情況。 結(jié)果：GBA在24h時表達量即有明顯降低；ProsaposinmRNA表達在24h和48h均沒有明顯改變，而在72h時表達明顯增強。 結(jié)論：800μM過氧化氫處理晶狀體上皮細胞后，GBAmRNA轉(zhuǎn)錄減少，在24h即達最低；過氧化氫處理72h后始見ProsaposinmRNA轉(zhuǎn)錄增加。 第3部分免疫細胞化學(xué)法檢測GCase和SaposinC在晶狀體上皮細胞中

6、的表達 目的：探討GCase和SaposinC在晶狀體上皮細胞中的表達。 方法：800μMH2O2作用24小時后免疫細胞化學(xué)法檢測GCase的表達；800μMH2O2作用72小時后免疫細胞化學(xué)法檢測SaposinC的表達。 結(jié)果：HLE-B3細胞漿內(nèi)兩種蛋白均有表達，在上述處理下GCase的表達降低，SaposinC的表達升高。 結(jié)論：氧化應(yīng)激狀態(tài)下晶狀體上皮細胞內(nèi)GCase的表達降低，SaposinC上

7、調(diào)。 第4部分流式細胞儀檢測H2O2處理后HLE-B3細胞調(diào)亡目的：探討H2O2是否誘導(dǎo)HLE-B3細胞誘導(dǎo)凋亡。方法：實驗組細胞分別以800μMH2O2作用24，48，72小時；流式細胞儀檢測實驗組和對照組細胞凋亡率。 結(jié)果：800μMH2O2處理24，48，72小時后凋亡率分別為10.1％(p＜0.01)、13.0％(p＜0.01)、20.1％(p＜0.01)。 結(jié)論：800μMH2O2可誘導(dǎo)HLE-B3細胞