外源性IL-6對膽管癌細(xì)胞QBC939的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分外源性IL-6對QBC939細(xì)胞凋亡及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響
　　 背景:膽管癌是一種來源于膽管上皮的，具有去分化及侵略性特征的惡性腫瘤，它的發(fā)病經(jīng)過一個從正常膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檠装Y膽管上皮細(xì)胞，然后去分化自主增生成為癌前病變最后癌變的過程，炎癥因子在這個過程中發(fā)生了重要的作用。IL-6被認(rèn)為是與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的炎癥因子，IL-6能夠刺激炎性膽管上皮細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞增殖，并且在其他細(xì)胞如CD34+造血干

2、細(xì)胞、肝臟星狀細(xì)胞、腎癌細(xì)胞株等的實驗研究中發(fā)現(xiàn)IL-6能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bax、Bcl-xL等的表達(dá)從而達(dá)到抗凋亡的作用。bcl-2是一種有抑制凋亡作用的癌基因，在多種腫瘤中已經(jīng)證實了bcl-2與腫瘤細(xì)胞逃避凋亡相關(guān)。將正常膽管細(xì)胞長期與感染性膽汁接觸可增加Bcl-2的表達(dá)，這提示細(xì)胞因子持續(xù)刺激與Bcl-2表達(dá)的改變之間可能存在聯(lián)系。
　　 目的:
　　 觀察外源性IL-6對膽管癌細(xì)胞系

3、QBC939凋亡以及Bcl-2 mRNA的影響。
　　 方法:
　　 1、用MTT法觀察外源性IL-6對膽管癌細(xì)胞QBC939增殖的作用；
　　 2、通過Annexin V/FITC和PI染色流式細(xì)胞分析檢測外源性IL-6對QBC939細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3、用RT-PCR檢測外源性IL-6對Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、外源性IL-6處理后，QBC939增

4、殖較對照組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，在一定劑量范圍內(nèi)，外源性IL-6促進(jìn)QBC939增殖的效應(yīng)有濃度依賴性，且劑量效應(yīng)呈對數(shù)關(guān)系(P<0.05)；
　　 2、外源性IL-6處理后QBC939凋亡率比對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；
　　 3、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL外源性IL-6培養(yǎng)QBC939細(xì)胞24小時后，RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA含量逐漸增加，統(tǒng)計學(xué)差異有

5、顯著性(P<0.01)并且與濃度正相關(guān)(r=1)。
　　 結(jié)論:
　　 1、在體外試驗中，外源性IL-6在一定劑量范圍內(nèi)呈濃度依賴方式促進(jìn)QBC939細(xì)胞生長，并抑制QBC939細(xì)胞凋亡；
　　 2、外源性IL-6抑制QBC939細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)相關(guān)。
　　 第二部分外源性IL-6調(diào)控膽管癌細(xì)胞QBC939 Bcl-2基因表達(dá)的分子機(jī)制研究
　　 背景:目前已知IL-6可以通過

6、與廣泛分布于膽管癌細(xì)胞膜表面的IL-6受體(IL-6 receptor，IL-6R)相結(jié)合形成IL-6/IL-6R復(fù)合物，激活如下兩條信號通路：JAK/STAT和Ras/MAPK。IL-6/IL-6R復(fù)合物可直接激活JAK蛋白酪氨酸激酶，然后進(jìn)入JAK/STAT通路激活信號分子STAT和Tec。這些信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮IL-6的促細(xì)胞生長、分化和抗凋亡作用。另一方面，IL-6/IL-6R復(fù)合物可誘導(dǎo)Src同源膠原

7、蛋白與生長因子受體結(jié)合蛋白-2(SHP2)復(fù)合物形成和活化，然后與鳥嘌呤核苷酸交換因子結(jié)合，激活Ras蛋白。活化的Ras轉(zhuǎn)導(dǎo)信號參與絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)途徑。正常膽管細(xì)胞長期與感染性膽汁接觸可增加Bcl-2的表達(dá)，且膽管癌Bcl-2的表達(dá)增加，這提示細(xì)胞因子持續(xù)刺激與Bcl-2的表達(dá)改變之間存在可能的聯(lián)系。2000年，Michel等用IL-6、干擾素-a、胰島素樣生長因子-1(insulin-likegrowth facto

8、r1)處理骨髓瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6能上調(diào)Mcl-1表達(dá)，2007年有研究者在另外一項CD34+造血干細(xì)胞的實驗中研究發(fā)現(xiàn)IL-6可以通過JAK/STAT通路上調(diào)Bcl-2表達(dá)。
　　 目的:
　　 分別阻滯JAK/STAT和Ras/MAPK途徑，探討外源性IL-6調(diào)控膽管癌細(xì)胞系QBC939Bcl-2 mRNA表達(dá)的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、采用IL-6刺激人膽管癌細(xì)胞QBC939使Bcl-

9、2mRNA表達(dá)上調(diào)，再分別用JAK/STAT拮抗劑AG490及MEK/ERK拮抗劑UO126處理；
　　 2、MTT法檢測細(xì)胞的增殖狀態(tài)，Annexin V/FITC和PI染色流式細(xì)胞儀分析凋亡情況；
　　 3、RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA水平；
　　 4、Western印跡法檢測p-STAT3和P-ERK1的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、UO126和AG490處理后，QBC939細(xì)

10、胞增殖程度較IL-6組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；
　　 2、UO126和AG490處理后，QBC939細(xì)胞凋亡率分別提高為18.8±4.13％和20.3±3.88％，與IL-6組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但兩組間無明顯差異(P>0.05)；
　　 3、AG490處理后，Bcl-2 mRNA含量比IL-6組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 4、對照組QBC939細(xì)胞有P-

11、STAT3和p-ERK表達(dá)；IL-6作用于QBC939細(xì)胞株后，p-STAT3和p-ERK1含量均較對照組明顯升高；AG490作用后，p-STAT3含量明顯下降；UO126作用后，p-ERK1含量明顯下降。
　　 結(jié)論:
　　 1、IL-6可同時激活JAK/STAT和Ras/MAPK遴徑；
　　 2、主要通過JAK/STAT途徑調(diào)節(jié)QBC939細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)。
　　 第三部分外源性IL-6對

12、QBC939裸鼠移植瘤生長的影響
　　 背景:BALB/C裸小鼠是一種近交系小鼠，后代基因純合程度高，個體間差異小，此種小鼠先天無毛無胸腺，T淋巴功能完全缺乏，對異種移植不發(fā)生排斥反應(yīng)，因此特別適用于建立移植瘤模型。移植后的人體腫瘤在裸小鼠體內(nèi)仍保持有原有組織形態(tài)、免疫學(xué)特點(diǎn)及特有的染色體組型。目前建立裸鼠移植瘤模型是一種較為理想的研究腫瘤在體內(nèi)的生物學(xué)特性及調(diào)控機(jī)制的模型系統(tǒng)。
　　 目的:
　　 建立QBC9

13、39裸鼠移植瘤模型，觀察外源性IL-6在體內(nèi)對膽管癌細(xì)胞系QBC939生長的影響。
　　 方法:
　　 1、采用皮下注射法建立裸鼠移植瘤模型；
　　 2、分別使用IL-6及AG490進(jìn)行腹腔注射給藥，觀察移植瘤生長情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、本實驗成功建立裸鼠體內(nèi)膽管癌皮下移植瘤模型；
　　 2、移植瘤在無藥物干預(yù)時有自主生長，IL-6干預(yù)后移植瘤生長明顯增快，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0