PI3K-Akt信號通路調(diào)控胞內(nèi)布魯氏菌16M存活的分子機制研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引發(fā)的一種人畜共患傳染病。布魯氏菌能夠抑制細胞的凋亡和促進細胞的自噬，導(dǎo)致布魯氏菌在吞噬細胞中生存繁殖，它能引起人、畜多器官損傷和慢性感染，給人類健康和畜牧業(yè)和諧發(fā)展帶來嚴重威脅。已有研究表明PI3K/Akt信號通路不僅參與細胞凋亡、自噬等多種細胞活動和生物學效應(yīng)還與病原體在細胞內(nèi)的生存繁殖密切相關(guān)，然而，該信號通路否參與了布魯氏菌在宿主細胞內(nèi)的生存繁殖尚鮮有報道，本研究通過探討PI3K/

2、Akt信號通路對胞內(nèi)布魯氏菌生存繁殖的影響及與布魯氏菌介導(dǎo)的細胞凋亡、自噬的影響，揭示布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機制，為布魯氏菌病新藥物研發(fā)、防治及家畜抗病育種工作奠定基礎(chǔ)。
　　目的：⑴檢測布魯氏菌及脂多糖是否激活小鼠巨噬細胞的PI3K/Akt信號通路。⑵阻斷PI3K/Akt信號通路后檢測對羊種布魯氏菌16M生存繁殖在宿主體內(nèi)外的影響。⑶阻斷PI3K/Akt信號通路后檢測對羊種布魯氏菌16M介導(dǎo)的細胞凋亡的影響。⑷阻斷

3、PI3K/Akt信號通路后檢測對羊種布魯氏菌16M介導(dǎo)的細胞自噬的影響。（5）檢測PI3K催化亞基p110α在羊種布魯氏菌16M侵染巨噬細胞過程中的功能。從而揭示布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機制，為布魯氏菌病新藥物研發(fā)、防治及家畜抗病育種工作奠定基礎(chǔ)。
　　方法：①應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測：布魯氏菌16M（16M）、其它菌株和脂多糖LPS對巨噬細胞內(nèi)p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達的影響；以及

4、16M對巨噬細胞內(nèi)p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達的影響是否與侵染時間和侵染比例有關(guān)；PI3K抑制劑2-(4-嗎琳基)-8-苯基-4氫-1-苯并毗喃-4酮（LY）對16M介導(dǎo)p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達的抑制效果。②抑制劑LY（LY）與巨噬細胞孵育1h，然后，用16M侵染巨噬細胞，未經(jīng)抑制劑LY處理的細胞作為對照組，分別在30min、45min、4h、12h和24h檢測布魯氏菌的CFU；用ELIS

5、A檢測細胞上清液中IFN-γ、IL-12p70和TNF-α的分泌。選取6-8周齡雌性BALB/c小白鼠（每組10只），腹腔注射抑制劑LY（20mg/kg/day）并持續(xù)到實驗結(jié)束，給藥5天后感染16M，劑量為LD100(4.6×108CFU/0.2mL)和LD50(6.3×107CFU/0.2mL)，統(tǒng)計小鼠的死亡率；感染1×106CFU/0.2mL劑量的16M，取小鼠脾臟和肝臟，計算16M的含量；利用病理切片技術(shù)，觀察病理變化。③抑制

6、劑LY與巨噬細胞作用1h，然后，用16M侵染巨噬細胞，未經(jīng)抑制劑LY處理的細胞作為對照組，利用caspase-3、8、9活性檢測試劑盒檢測其活性變化；利用實時定量PCR和Western blot檢測凋亡相關(guān)基因的表達；利用流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。④用慢病毒包裝Plex-MSC-EGFP-LC3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染巨噬細胞，抑制劑LY與轉(zhuǎn)染的巨噬細胞作用1h，然后用16M感染細胞，在12h和24h，用共聚焦顯微鏡檢查EGFP-LC3綠色聚點，

7、及溶酶體與EGFP-LC3綠色聚點的共定位；利用投射電鏡觀察細胞中包含16M的自噬泡的數(shù)量。⑤對p110α基因設(shè)計四條特異性陽性siRNA分子和一條陰性siRNA分子，構(gòu)建shRNA慢病毒表達載體pLentiLox-siRNA，將其轉(zhuǎn)染巨噬細胞，通過熒光實時定量PCR技術(shù)篩選出干擾效果最好的pLentiLox-siRNA質(zhì)粒；將最優(yōu)pLentiLox-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細胞。
　　結(jié)果：⑴布魯氏菌16M感染細胞

8、后，p-Akt(S473)和p-Akt(T308)在第1h表達量最高，且顯著高于對照組和其他組（P<0.05），在第8h、12h和24h其水平恢復(fù)正常，與對照組相比其表達量無顯著差異（ P>0.05）。粗糙型的RB51、M5Δpgm感染的細胞中p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達顯著低于光滑型的M5、16M和S2308（P<0.01）。抑制劑LY對16M介導(dǎo)的p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達的阻斷具有濃度

9、依賴性。⑵在30min、45min、4h、12h和24h，LY處理組細胞中的細菌數(shù)量顯著低于對照組細胞(P<0.05)。在第10天，攻LD100和LD50劑量后16M+LY組的小鼠成活率分別為30％和60%，對照16M組小鼠成活率分別為0和30%；16M+LY組的小鼠血清中的IFN-γ、IL-12p70和TNF-α顯著高于16M組（P<0.01）；16M+LY組小鼠中CD8+T細胞百分比顯著高于16M組（P<0.05）；16M+LY組小

10、鼠的脾臟和肝臟的病理變化都比對照16M組小鼠較輕。⑶在4h、12h和24h，16M+LY組細胞caspase-3的OD405都顯著高于對照組細胞（P<0.05）；caspase-9的OD405值與caspase-3趨勢一致；16M+LY組細胞中Bax的mRNA相對表達量顯著高于16M組細胞(P<0.01），Bcl-2 mRNA相對表達量顯著低于16M組細胞（P<0.01），16M+LY組細胞中的cleaved PARP、Bax和Cyto

11、solic Cyt-c的蛋白表達量顯著高于16M組（P<0.01）；16M+LY組細胞凋亡率顯著高于16M組細胞（P<0.01）。⑷在12h和24h，16M+LY組的綠色熒光顆粒顯著低于16M組細胞（P<0.01）；16M+LY組細胞中Beclin1和ULK1 mRNA相對表達量顯著低于16M組細胞（P<0.01）；16M+LY組細胞中的LC3-II/LC3-I轉(zhuǎn)換率、Beclin1和ULK1的蛋白水平顯著低于16M組細胞（P<0.01

12、）；16M+LY組細胞中包含16M的自噬泡與16M組細胞相比明顯減少（P<0.01）。⑸在30min、45min和4h，p110α基因沉默組與正常細胞組內(nèi)16M的CFU無顯著差異（P>0.05），但在12h和24h時差異顯著（P<0.05）；在12h和24h，沉默p110α基因后，與對照組相比，感染細胞的caspase-3活性顯著提高(P<0.01）；促凋亡相關(guān)蛋白cleavedPARP、Bax和Cytosolic Cyt-c細胞凋亡率

13、也顯著提高（P<0.01）；16M介導(dǎo)的IL-12p70和TNF-α的水平顯著提高（P<0.01）。
　　結(jié)論：①布魯氏菌及其LPS可激活PI3K/Akt信號通路。②抑制劑LY可顯著降低16M在宿主體內(nèi)和體外的存活，可提高宿主的細胞免疫抵抗16M感染。③抑制劑LY可顯著提高16M介導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞凋亡，并且這種細胞凋亡依賴caspase-3和caspase-9的活性。④抑制劑LY可顯著抑制16M介導(dǎo)的RAW264.7巨