肺癌紫杉醇耐藥的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、第一部分 背景與目的：非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是常見的惡性腫瘤，化學(xué)藥物治療(簡稱化療)是肺癌綜合治療的一個(gè)重要部分。腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是影響肺癌化療療效的主要障礙之一。紫杉醇(paclitaxel)作為一種新型的抗腫瘤藥物，在NSCLC治療上已顯示出良好的發(fā)展前景。然而，其耐藥性的產(chǎn)生以及越來越多交叉耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，已成為一道

2、不容忽視的難題。因此，闡明其耐藥機(jī)制，對(duì)于更好地選用治療策略、篩選合適病人節(jié)約醫(yī)療資源、最大限度地避免或逆轉(zhuǎn)耐藥性的產(chǎn)生及化療療效的提高具有十分重要的意義。紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生是一個(gè)多途徑過程，而體外建立多藥耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥機(jī)制的重要手段。為了更深入地探討非小細(xì)胞肺癌紫杉醇耐藥產(chǎn)生機(jī)制，本研究擬構(gòu)建耐紫杉醇的人肺腺癌細(xì)胞系，為后面耐藥相關(guān)蛋白的研究打下基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用抗腫瘤藥物紫杉醇(泰素，taxol)以體外

3、濃度遞增和短時(shí)作用法誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞株。用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細(xì)胞的耐藥指數(shù)及對(duì)多種抗癌藥物的敏感性；測定細(xì)胞群體倍增時(shí)間和細(xì)胞生長曲線；免疫組織化學(xué)檢測P-糖蛋白(P-gp)、β-微管蛋白(β-tubulin)、GST-π、ERCC1、P53等耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)；RT-PCR檢測III型β微管蛋白在親代及耐藥細(xì)胞中mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：經(jīng)過15個(gè)月逐步增加劑量的藥物誘導(dǎo)和克隆篩選，建立了能夠在Img/L

4、紫杉醇濃度下長期培養(yǎng)生長的細(xì)胞株，命名為人肺腺癌紫杉醇耐藥株A549/Taxol。經(jīng)MTT法檢測，A549/Taxol細(xì)胞的紫杉醇半數(shù)抑制濃度(IC50)是親代A549細(xì)胞的512.8倍，群體倍增時(shí)間是親代細(xì)胞的1.28倍，對(duì)紫杉醇、絲裂霉素、長春新堿、諾維苯的耐藥指數(shù)依次為512.8、66.48、4.88、2.66，表現(xiàn)為典型的MDR表型；而對(duì)順鉑、健擇無交叉耐藥。免疫組化檢測見A549/Taxol細(xì)胞中高表達(dá)P-糖蛋白、β-微管蛋白

5、。RT-PCR檢測III型β-微管蛋白在耐藥細(xì)胞中mRNA表達(dá)高于其親代細(xì)胞系。 結(jié)論：建立了穩(wěn)定耐紫杉醇的A549/Taxol，并呈多藥耐藥特性。其耐藥機(jī)制可能與P-糖蛋白(P170)、β-微管蛋白等蛋白表達(dá)水平增高有關(guān)。 第二部分 背景與目的：既往大量的研究結(jié)果提示紫杉醇耐藥現(xiàn)象的發(fā)生不是由單一基因或蛋白改變所引起，而可能是由多種蛋白網(wǎng)絡(luò)式共同作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)在第一部分建立了肺腺癌耐紫杉醇細(xì)胞株，因此本研究

6、擬在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用高通量篩查差異表達(dá)蛋白的實(shí)驗(yàn)技術(shù)——蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較人肺腺癌細(xì)胞株(A549)和紫杉醇耐藥細(xì)胞株(A549/Taxol)間差異蛋白的表達(dá)，擬發(fā)現(xiàn)與肺癌耐紫杉醇相關(guān)的特異蛋白標(biāo)志物，希望能對(duì)非小細(xì)胞肺癌紫杉醇耐藥機(jī)制進(jìn)行探討，為今后尋找非小細(xì)胞肺癌的治療靶點(diǎn)或逆轉(zhuǎn)耐藥提供理論依據(jù)。 方法：提取非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549及紫杉醇耐藥細(xì)胞株A549-Taxol的總蛋白，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)分離，

7、獲得二者高質(zhì)量的蛋白表達(dá)譜，經(jīng)Imagemaster5.0軟件比較分析，篩選出二者間差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，通過質(zhì)譜鑒定差異蛋白。應(yīng)用Western blot技術(shù)對(duì)篩選出的CK18蛋白作進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)果：獲得了分辨率高、重復(fù)性好的肺癌耐紫杉醇細(xì)胞系及親代細(xì)胞系雙向電泳圖譜。Imagemaster軟件分析獲得差異大于2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有80個(gè)，其中33個(gè)在耐藥細(xì)胞系中上調(diào)，47個(gè)下調(diào)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定了20種蛋白，鑒定的蛋白涉及細(xì)胞骨架蛋

8、白、代謝酶類、分子伴侶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白等。差異明顯的蛋白中，β-微管蛋白在紫杉醇耐藥中研究比較成熟，而CK18蛋白與紫杉醇耐藥關(guān)系的文獻(xiàn)較少，由此考慮CK18可能為肺癌紫杉醇耐藥的新靶點(diǎn)，應(yīng)用Western blot技術(shù)對(duì)它作進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CK18表達(dá)水平在紫杉醇耐藥細(xì)胞株中較親本株中升高。 結(jié)論：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549及紫杉醇耐藥細(xì)胞株A549-Taxol相比，有許多蛋白在表達(dá)水平發(fā)生了顯著改變。應(yīng)用雙向電泳技術(shù)整體展

9、示了紫杉醇耐藥細(xì)胞株及敏感細(xì)胞株的蛋白表達(dá)譜，并分析、鑒定、篩選出與紫杉醇耐藥相關(guān)的差異蛋白，為進(jìn)一步從多因素角度研究認(rèn)識(shí)紫杉醇耐藥機(jī)制提供了新的線索。通過Western blot對(duì)CK18鑒定獲得了滿意的CK18蛋白免疫印跡圖譜，推測此蛋白有望成為肺癌紫杉醇耐藥的新靶點(diǎn)。 第三部分 背景與目的：本研究第二部分通過對(duì)A549肺癌細(xì)胞株及A549/Taxol紫杉醇耐藥細(xì)胞株的總蛋白提取，應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)獲得

10、了高質(zhì)量的蛋白表達(dá)譜，經(jīng)Imagemaster5.O軟件比較分析、質(zhì)譜鑒定出了差異蛋白，通過Western blot再次驗(yàn)證，確認(rèn)CK18為差異明顯的蛋白之一。由于前期研究發(fā)現(xiàn)CK18作為腫瘤治療療效預(yù)測因子已能在外周血清中測得，基于以上理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本部分?jǐn)M前瞻性地獲取晚期非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療患者耐藥前后外周血，作為自身對(duì)照以ELISA法檢測其中的CK18水平，來評(píng)價(jià)CK18與紫杉醇耐藥的關(guān)系，并為第二部分作進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證。

11、 方法：20例晚期非小細(xì)胞肺癌患者，紫杉醇175mg/m2，dl靜脈滴入、卡鉑以AUC=5計(jì)算用量dl靜脈滴入，21天為一個(gè)周期，2～6個(gè)周期。按RECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定療效。在患者化療一個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效為病情穩(wěn)定(SD)或以上，抽取外周血5ml抗凝，予以規(guī)范化療，每周期后重新評(píng)價(jià)療效，直到出現(xiàn)病情進(jìn)展(PD)后再次抽取外周血5ml抗凝。酶聯(lián)免疫吸附法檢測耐藥前后血清中CK18含量作為自身對(duì)照。 結(jié)果：20例患者耐藥前血清CK1

12、8水平為0.3559±0.1990ng/ml；耐藥后為0.5656±0.1893ng/ml。4例患者血清CK18水平略有下降(<20％)，但都為化療2次，即抽血后第一次評(píng)價(jià)療效時(shí)出現(xiàn)耐藥；其余16例全部都出現(xiàn)升高(化療2次以上出現(xiàn)耐藥)，其中13例增高大于20％，最高達(dá)947.17％。配對(duì)t檢驗(yàn)顯示P=0.006，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：CK18的檢測有助于預(yù)測紫杉醇化療的療效，并且對(duì)獲得性耐藥意義可能更大，可以為晚期N