針對NgR1和PirB靶向治療改善小鼠腦缺血后神經(jīng)功能的研究.pdf

1、腦卒中是中國成年人中致死、致殘的首要病因,同時也是西方國家第二大致死病因。不僅如此,腦卒中后的幸存者還相繼發(fā)生了偏癱、失語等后遺癥從而使這些人的生活質量嚴重下降。目前,纖維蛋白溶解療法和抗血小板聚集藥物的應用是治療腦卒中最有效的方法。但是這些療法時間窗狹窄(<4.5h),只有約10％的腦卒中后患者適用于再此療法且不能解決術后多種后遺癥。至今為止,腦卒中后神經(jīng)功能障礙的有效方法僅有復健鍛煉,但這種方法所需時間長且收效甚微。因此,研制出有效

2、藥物從根本上解決腦卒中后長期的神經(jīng)功能障礙刻不容緩。
　　Nogo-A蛋白的發(fā)現(xiàn),為治療中風后神經(jīng)功能障礙帶來了希望。Nogo-A有抗CNS損傷后的突觸重建的作用。NgR1是Nogo-A的受體,抑制NgR1能促進軸突再生。我們前期研究發(fā)現(xiàn),包含Nogo-A特定功能區(qū)域的TAT-M9蛋白無論在體內還是體外實驗中均能在急性期減少活性氧的生成,抑制細胞凋亡。同時,NgR1的抗體蛋白TAT-NEP1-40能抑制Nogo-A作用增強大鼠腦缺

3、血后短期的神經(jīng)突觸可塑性和神經(jīng)功能。而最近報道稱,腦缺血損傷后28天內神經(jīng)元Nogo-A的表達在腦損傷早期(7d)下降,之后逐漸升高。依據(jù)Nogo-A在腦缺血后的空間表達特異性,我們擬用TAT-M9進行急性期(7d)的抗凋亡治療,Nogo-A表達高峰時應用TAT-NEP1-40促進突觸重建,深入研究聯(lián)合應用TAT-M9和TAT-NEP1-40的長期保護作用,為缺血性腦卒中提供新的治療方法。
　　PirB也是髓磷脂蛋白的功能性受體。

4、有研究發(fā)現(xiàn),基因敲除PirB后會引起比敲除NgR1更多的軸突再生。故此,推測PirB在髓磷脂抑制作用中占有更大的比例,提示PirB也可能成為腦卒中后康復治療的又一個作用靶點。為了抑制PirB的作用,我們利用PirB的細胞外段合成了PEP。然而,PEP的分子量過大,不能通過血腦屏障。因此,我們應用蛋白轉導技術再一次合成了具有血腦屏障通透性的TAT-PEP融合蛋白。為進一步明確PirB對缺血性腦卒中的治療作用提供了研究基礎。
　　因此

5、,本課題以小鼠全腦缺血(BCCAO)模型和海馬神經(jīng)元細胞系HT22氧糖剝奪(OGD)模型為對象,應用免疫組織化學、蛋白印記和神經(jīng)行為學等方法,觀察聯(lián)合應用TAT-M9和TAT-NEP1-40及TAT-PEP對腦缺血損傷后長期神經(jīng)保護作用,旨在提供針對缺血性腦卒中治療新的干預目標和藥物,并且腦卒中后的治療模式提供新思路。
　　實驗一:TAT-M9對腦缺血損傷急性期的保護作用
　　目的:對小鼠全腦缺血7d后TAT-M9腦保護作用

6、的觀察。
　　方法:采用C57BL/6小鼠,建立BCCAO模型,將小鼠隨機分為三組: Sham組(假手術組,n=6),Control組(0.5ml生理鹽水,qd ip,n=6)和TAT-M9組(10mg/kg,qd ip,n=6),再灌注即刻給藥,之后每天同一時間段行藥物腹腔注射,連續(xù)7d。于首次藥物注射6h后,通過免疫組化染色觀察藥物通過血腦屏障情況。于第7d行總體運動評分(TMS)觀察BCCAO小鼠術的自主神經(jīng)運動能力。應用H

7、E染色觀察并計數(shù)腦缺血7d后神經(jīng)元的存活情況。采用TUNEL染色觀察并計數(shù)小鼠缺血后7d海馬神經(jīng)元的凋亡情況,通過western blot明確Bcl-2和Bax在海馬的表達情況。
　　結果:成功建立了BCCAO模型,觀察到TAT-M9可通過血腦屏障進入腦缺血區(qū),并表達于海馬神經(jīng)元。TAT-M9治療可改善BCCAO術7d小鼠的TMS評分(P<0.01)。TAT-M9治療使BCCAO術后海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量顯著增加(P<0.01

8、)。TAT-M9治療還可顯著減少BCCAO術后7d海馬CA1區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.01),同時TAT-M9還提高Bcl-2/Bax的相對值(P<0.01)。
　　結論:TAT-M9能穿過血腦屏障進入腦海馬 CA1區(qū)和神經(jīng)元內,減少腦缺血再灌注損傷急性期(7d)的神經(jīng)元損傷,抑制神經(jīng)凋亡,減少神經(jīng)元丟失,促進神經(jīng)元存活,改善小鼠的自主神經(jīng)運動能力。
　　實驗二:聯(lián)合應用TAT-M9與TAT-NEP1-40對腦缺血

9、損傷的長期保護作用
　　目的:觀察聯(lián)合應用TAT-M9與TAT-NEP1-40對小鼠全腦缺血損傷后的長期神經(jīng)保護作用
　　方法:采用C57BL/6小鼠,建立BCCAO模型,小鼠隨機分成四組:Control組(0.5ml生理鹽水,qd ip,n=30),TAT-M9組(10mg/kg,qd ip,n=30),TAT-NEP1-40組(6mg/kg,qd ip,n=30),TAT-M9+TAT-NEP1-40組。TAT-M9組于

10、再灌注即刻給藥,持續(xù)7d;TAT-NEP1-40組于第8d給藥,持續(xù)至28d;TAT-M9+TAT-NEP1-40組于再灌注即刻給予TAT-M9,連續(xù)7d,從第8d給予TAT-NEP1-40,持續(xù)至28d。于BCCAO后28d通過被動回避平臺實驗、高架十字迷宮和恐懼箱實驗鑒定治療后小鼠的短期記憶能力。應用曠場實驗檢測小鼠自主運動功能。應用Morris水迷宮和T迷宮觀察小鼠長期記憶能力。通過免疫熒光染色觀察注射6h后TAT-NEP1-40

11、通過血腦屏障,及治療28d后缺血區(qū)軸突生長情況。通過western blot明確28d后BCCAO小鼠軸突生長因子(Tau、GAP43和MAP2)表達量的變化情況。
　　結果:成功建立了BCCAO模型,觀察到TAT-NEP1-40通過血腦屏障并表達于海馬神經(jīng)元。TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)合治療能促進Tau、GAP43和MAP2的表達(P<0.01),促進海馬CA1區(qū)神經(jīng)元軸突生長。TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)

12、合治療還能提高BCCAO小鼠28d后短期空間學習和記憶能力(P<0.01)及短期的關聯(lián)性和條件暗示性記憶能力(P<0.05);TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)合治療也改善了BCCAO小鼠28d后長期空間學習和記憶能力(P<0.01)以及長期工作記憶和參考記憶能力(P<0.01)。
　　結論:長時程聯(lián)合應用TAT-M9和TAT-NEP1-40能促進損傷區(qū)神經(jīng)軸突再生,提高腦缺血損傷后小鼠短期及長期的空間學習記憶能力,促進缺血損

13、傷后的神經(jīng)功能恢復。
　　實驗三:TAT-PEP對氧糖剝奪HT22細胞的保護作用及軸突生長的影響
　　目的:通過離體研究,明確TAT-PEP是否能促進氧糖剝奪(OGD)的HT22細胞的軸突再生。
　　方法:采用小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22細胞,首先應用MTT確定TAT-PEP的最佳有效濃度。其次將細胞分為三組:Sham組、OGD組、OGD+TAT-PEP組,細胞復氧后24h后,免疫熒光染色觀察3d后細胞軸突再生情況。<

14、br>　　結果:當TAT-PEP濃度為150μg/L時,OGD后細胞存活數(shù)最多。且TAT-PEP顯著促進OGD模型24h后的神經(jīng)元軸突生長。
　　結論:TAT-PEP可作用于神經(jīng)元,促進神經(jīng)突的再生。
　　實驗四:TAT-PEP長期治療對腦缺血損傷保護與神經(jīng)功能的影響
　　目的:通過在體實驗,明確TAT-PEP對小鼠全腦缺血后是否具有長期的神經(jīng)保護效應
　　方法:采用 C57BL/6小鼠,建立 BCCAO模型,將

15、小鼠隨機分為三組: Sham組(假手術組,n=40),Control組(0.5ml生理鹽水,qd ip,n=40)和TAT-PEP組(150μg/kg,qd ip,n=40),再灌注即刻給藥,連續(xù)28d。首次藥物注射6h、24h、48h后通過免疫熒光染色觀察藥物通過血腦屏障情況。應用HE染色和Nissl染色觀察并計數(shù)BCCAO小鼠7d后神經(jīng)元的存活情況。采用TUNEL染色統(tǒng)計BCCAO小鼠7d后神經(jīng)元的凋亡情況,應用 FJC染色統(tǒng)計 B

16、CCAO小鼠7d后神經(jīng)元變性情況。通過western blot明確28d后BCCAO小鼠軸突生長因子(Tau和GAP43)表達量的變化情況。MAP2免疫熒光檢測損傷區(qū)軸突再生情況。通過被動回避平臺試驗、高架十字迷宮和恐懼箱實驗鑒定治療后小鼠的短期記憶能力。應用曠場實驗檢測小鼠自主運動功能。應用Morris水迷宮和T迷宮觀察小鼠長期記憶能力。
　　結果:成功建立了BCCAO模型,觀察到TAT-PEP通過血腦屏障表達于海馬神經(jīng)元,并于

17、24h是表達量最高。TAT-PEP治療可明顯增加BCCAO術后7d神經(jīng)元在海馬CA1區(qū)的存活數(shù)量(P<0.01);TAT-PEP治療顯著增加BCCAO術后7d海馬CA1區(qū)Nissl陽性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.01);TAT-PEP治療可顯著減少BCCAO術后7d海馬CA1區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.01);TAT-PEP治療還可顯著減少BCCAO術后7d海馬CA1區(qū)FJC陽性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.01)。TAT-PEP治療能促進Tau

18、(P<0.05)及GAP43(P<0.01)的表達,促進海馬CA1區(qū)神經(jīng)元軸突生長。TAT-PEP治療還能提高BCCAO小鼠28d后短期空間學習記憶能力(P<0.05,P<0.01)及短期的關聯(lián)性和條件暗示性記憶能力(P<0.05);TAT-PEP治療也改善了BCCAO小鼠28d后長期空間學習記憶能力(P<0.05,P<0.01)以及長期工作記憶和參考記憶能力(P<0.05,P<0.01)。
　　結論:TAT-PEP治療能減少腦缺

19、血損傷后短期的神經(jīng)元的變性和凋亡,促進神經(jīng)元的存活。促進損傷區(qū)神經(jīng)軸突再生,提高腦缺血損傷后小鼠短期和長期的記憶能力。
　　小結:以上研究證實,TAT-M9、TAT-NEP1-40和TAT-PEP均能通過BBB,作用于損傷神經(jīng)元;TAT-M9可以減少缺血損傷區(qū)的神經(jīng)元丟失,抑制凋亡,改善缺血急性期的神經(jīng)功能;聯(lián)合應用TAT-M9和TAT-NEP1-40治療顯著促進軸突再生,對缺血性損傷后的小鼠的長期和短期的空間學習及記憶能力均明顯