注射用丹參多酚酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血小鼠神經(jīng)功能改善和神經(jīng)再生的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:腦卒中不僅會(huì)造成急性期腦損傷，由于損傷腦組織恢復(fù)不佳，也會(huì)引起恢復(fù)期運(yùn)動(dòng)功能的損傷，造成極高的致殘率。由于rt-PA過(guò)窄的時(shí)間窗限制，在腦卒中發(fā)生后的24小時(shí)內(nèi)患者常常不能得到及時(shí)治療，因此開(kāi)始于腦卒中發(fā)生24小時(shí)之后的延遲治療越來(lái)越受到人們的重視與關(guān)注。丹參作為一種中藥，已被各種研究證實(shí)具備神經(jīng)保護(hù)作用，并廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中患者。注射用丹參多酚酸是從丹參中提取的復(fù)方成分，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在腦卒中的急性期具有神經(jīng)保護(hù)作用，但對(duì)于

2、這種藥物對(duì)腦卒中延遲治療效果及其是否可改善腦卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)及可能的作用機(jī)制卻研究甚少。
　　成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)存在兩個(gè)能產(chǎn)生大量神經(jīng)元的生發(fā)區(qū)，分別為側(cè)腦室的腦室下帶(subventricularzone，SVZ)和海馬的顆粒下帶(subgranularzone，SGZ)。在一些刺激如缺血性腦卒中的作用下，SVZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞能被激活而增殖并向缺血半暗帶遷移，分化成熟以取代梗死區(qū)受損的神經(jīng)元，以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。Sonic h

3、edgehog(Shh)信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)和多種器官的正常形成和構(gòu)建中起重要作用，近年來(lái)該信號(hào)因與神經(jīng)組織發(fā)生及神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化、遷移的密切關(guān)系而備受關(guān)注。
　　一些神經(jīng)生長(zhǎng)因子可促進(jìn)成年動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)再生，在缺血性腦卒中的恢復(fù)期與運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)。Brain derived neurotrophic factor(BDNF)和Nerve Growth Facto(NGF)已證實(shí)在生理和病理?xiàng)l件下均與腦內(nèi)SVZ區(qū)神經(jīng)前

4、體細(xì)胞的增殖、分化及遷移緊密相關(guān)。但是，對(duì)于Shh信號(hào)通路與BDNF及NGF表達(dá)的關(guān)系仍知之甚少。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究注射用丹參多酚酸的延遲性治療可否促進(jìn)缺血性腦卒中后恢復(fù)期神經(jīng)功能的恢復(fù)和神經(jīng)再生，且Shh信號(hào)通路是否為該藥物長(zhǎng)時(shí)程應(yīng)用的作用靶點(diǎn)。
　　方法:采用永久性結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈并在顯微鏡下燒灼右側(cè)大腦中動(dòng)脈的皮層分支以制備C57BL/6小鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)，梗死組(

5、MCAO)，小劑量用藥組(Sals-L)，大劑量用藥組(Sals-H)，抑制劑組(CYC)，抑制劑+用藥組(CYC+Sals)。各組小鼠分別于造模后24小時(shí)開(kāi)始腹腔給予不同劑量的藥物(15 mg/kg，30 mg/kg)或抑制劑（10 mg/kg），連續(xù)14天。分別于術(shù)后1、7、14、21、28天對(duì)各組小鼠進(jìn)行Rotarod及mNSS神經(jīng)功能評(píng)分，于28天用HE染色法測(cè)定腦梗死體積，于術(shù)后7、14、28天用免疫熒光染色測(cè)定神經(jīng)再生相關(guān)指

6、標(biāo)（包括神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化、遷移及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖、分化等的相關(guān)指標(biāo)），于術(shù)后3、7、14天用免疫印記(Western blot)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定Shh信號(hào)通路上相關(guān)因子(Shh，Ptch，Gli1)及BDNF、NGF的蛋白及基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、注射用丹參多酚酸改善了腦缺血小鼠的神經(jīng)功能
　　對(duì)梗死組、小劑量用藥組、大劑量用藥組、抑制劑組、抑制劑+用藥組組小鼠于術(shù)后1、

7、7、14、21、28天進(jìn)行Rotarod和mNSS神經(jīng)功能評(píng)分。梗死后24小時(shí)，各組小鼠均顯示了神經(jīng)缺損癥狀，各組間神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。與梗死組相比，大劑量用藥組的神經(jīng)功能評(píng)分在14天(Rotarod)及21天（mNSS）明顯改善，且持續(xù)到梗死后第28天，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與大劑量用藥組相比，抑制劑組、抑制劑+用藥組（劑量同大劑量用藥組）的神經(jīng)功能評(píng)分在14天(Rotarod)及21天(mNS

8、S)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但兩者與梗死組相比在任何時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2、注射用丹參多酚酸對(duì)腦梗死體積無(wú)影響
　　造模后第28天，Sham組腦組織未見(jiàn)梗死灶，用藥組梗死體積較梗死組相比未見(jiàn)明顯減(Sals vs.MCAO:11.39％±1.73％ vs.11.60％±2.07％，P＞0.05)。
　　3、注射用丹參多酚酸通過(guò)介導(dǎo)Shh信號(hào)通路促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)再生
　

9、　Confocal結(jié)果顯示，術(shù)后7、14、28天，用藥組（之后實(shí)驗(yàn)中用藥組劑量同大劑量用藥組）同梗死組相比，梗死側(cè)dSVZ區(qū)BrdU+細(xì)胞數(shù)及dSVZ區(qū)、vSVZ區(qū)DCX密度顯著增多，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，梗死對(duì)側(cè)未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，抑制劑+用藥組同用藥組相比在梗死側(cè)上述指標(biāo)均有顯著性下降(P＜0.05);DCX與BrdU共標(biāo)表明梗死后神經(jīng)再生，且造模后7、14、28天用藥組DCX/BrdU共標(biāo)細(xì)胞數(shù)占Brd

10、U陽(yáng)性細(xì)胞百分比較梗死組相比在梗死側(cè)具有顯著性增加，同時(shí)應(yīng)用抑制劑則可逆轉(zhuǎn)上述作用(P＜0.05)。
　　Confocal結(jié)果顯示，在梗死灶周邊的皮層和紋狀體也可觀察到DCX+細(xì)胞，說(shuō)明神經(jīng)前體細(xì)胞在梗死后發(fā)生了由SVZ區(qū)至梗死區(qū)的遷移。在梗死區(qū)域周邊可以觀察到NeuN、GFAP、Iba1與BrdU的共標(biāo)，說(shuō)明在腦梗死發(fā)生后神經(jīng)前體細(xì)胞可以遷移至梗死區(qū)周邊并分化成熟以取代受損的神經(jīng)細(xì)胞。
　　通過(guò)對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的熒光染色發(fā)現(xiàn)

11、SVZ區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞具有很多分支，梗死后28天無(wú)論用藥組還是梗死組DCX/Tuj-1共標(biāo)均占很大一部分，但用藥組DCX/MAP-2及DCX/SMI312共標(biāo)數(shù)均較梗死組增多，說(shuō)明藥物可以促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的突起向成熟的樹(shù)突及軸突分化。
　　此外我們還觀察了SVZ區(qū)及胼胝體區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖及分化情況。結(jié)果表明，梗死后28天，在用藥組梗死側(cè)SVZ區(qū)NG2+細(xì)胞數(shù)較梗死組相比有增多，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，此差異并未出現(xiàn)在

12、梗死對(duì)側(cè)(P＞0.05)。無(wú)論在SVZ區(qū)還是梗死灶周邊的胼胝體區(qū)域均可以觀察到NG2/BrdU的共標(biāo)。此外，梗死后28天，梗死灶周?chē)蓦阵w區(qū)用藥組CNPase/BrdU共標(biāo)細(xì)胞數(shù)占BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率較梗死組增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4、注射用丹參多酚酸上調(diào)Shh、Ptch、Gli1的蛋白及基因表達(dá)，上調(diào)BDNF及NGF的表達(dá)
　　Confocal結(jié)果顯示DCX/Shh、NeuN/Shh、MAP-2/Sh

13、h、SMI312/Shh均有共標(biāo)，且BDNF及NGF也均與DCX、Tuj-1、NeuN、MAP-2、SMI312共標(biāo)。
　　Western blot，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示:梗死后3、7、14天，梗死組小鼠缺血側(cè)腦皮層的Shh、Ptch、Gli1的水平上調(diào)，藥物干預(yù)后，其水平較梗死組相比增多，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，梗死對(duì)側(cè)皮層上述指標(biāo)未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。BDNF、NGF在梗死后第3天并未在用藥組及梗

14、死組之間出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而第7天及第14天，梗死側(cè)皮層在用藥組兩者的表達(dá)同梗死組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，梗死對(duì)側(cè)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　Western blot結(jié)果顯示:梗死后14天，抑制劑+用藥組小鼠較用藥組小鼠相比，shh信號(hào)通路上的指標(biāo)Ptch及Gli1在梗死側(cè)皮層的表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)BDNF和NGF的表達(dá)在梗死側(cè)皮層也下調(diào)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。但Shh