注射用丹參多酚酸對(duì)急性局灶性腦梗死小鼠血腦屏障的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:腦卒中是導(dǎo)致人類致殘和致死的主要病因之一，其中以急性腦梗死最為常見(jiàn)。腦水腫是導(dǎo)致急性腦梗死后機(jī)體死亡的首因。大量血管內(nèi)物質(zhì)透過(guò)破壞的血腦屏障涌入腦實(shí)質(zhì)，腦容量的急速膨脹導(dǎo)致了機(jī)體的死亡。氧化應(yīng)激損傷血腦屏障，形成血管源性水腫的病理機(jī)制已被充分證明。急性腦梗死發(fā)生后，腦組織內(nèi)積累大量的活性氧自由基，不僅直接攻擊血腦屏障膜結(jié)構(gòu)，還觸發(fā)由細(xì)胞膜上的離子通道失活的相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血管的通透性增加，加重腦水腫。減輕腦水腫的治療策略有利于降

2、低急性腦梗死的死亡率和致殘率。因此，開(kāi)發(fā)保護(hù)血腦屏障的藥物有望成為急性腦梗死的有效策略。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化藥物白藜蘆醇、雙環(huán)醇和丹皮酚等可以改善腦梗死后血腦屏障的通透性。注射用丹參多酚酸(salvianolic acids，SAs)是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的多種丹酚酸的水溶性混合物，具有對(duì)抗心肌缺血損傷的作用，廣泛應(yīng)用于治療心肌缺血性疾病。其主要由丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)、丹酚酸D、丹酚酸E、迷迭香酸

3、、紫草酸組成，各單體表現(xiàn)出以較強(qiáng)抗氧化作用為特點(diǎn)的多方面藥理作用。其中SAB已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)有明確的腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制小鼠永久性大腦中動(dòng)脈栓塞模型(permanent middle cerebr alanery occlusion，pMCAO)，應(yīng)用SAs及陽(yáng)性對(duì)照SAB進(jìn)行干預(yù)，評(píng)價(jià)腦梗死后血腦屏障滲透性、神經(jīng)功能、腦梗死體積、腦水腫，旨在證實(shí)其腦保護(hù)作用并探討其可能機(jī)制。
　　方法:采用成年健康雄性CD-1小鼠，應(yīng)用改良

4、的Longa線栓法制作小鼠pMCAO模型。實(shí)驗(yàn)一探究SAs的血腦屏障保護(hù)作用。72只小鼠隨機(jī)分為四組（每組18只）:Sham組，pMACO組，SAs組(pMACO+SAs15mg/kg)，SAB組(pMACO+SAB10mg/kg)。藥物干預(yù)組在大腦中動(dòng)脈栓塞后即刻給予藥物腹腔注射，相應(yīng)的pMCAO組與Sham組給予等體積的生理鹽水。其中每組6只于藥物干預(yù)后即刻給予尾靜脈注射2％伊文斯蘭溶液(4ml/kg)，24小時(shí)后心臟灌注生理鹽水，

5、留取腦組織進(jìn)行伊文斯蘭滲透量測(cè)定。每組其余12只于術(shù)后24小時(shí)進(jìn)行腦保護(hù)作用檢測(cè):包括神經(jīng)功能評(píng)分，腦水含量測(cè)定以及TTC染色法測(cè)定梗死體積。實(shí)驗(yàn)二進(jìn)行SAs血腦屏障保護(hù)機(jī)制的探索。每組6只同時(shí)進(jìn)行SOD活性和MDA含量檢測(cè)，評(píng)定SAs抗氧化能力。每組3只蛋白免疫印跡法測(cè)定claudin-5，occludin，MMP-9和AQP-4蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1注射用丹參多酚酸能改善神經(jīng)功能缺損。
　　術(shù)后24小時(shí)對(duì)

6、Sham組、pMCAO組、SAs組、SAB組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，用Mann-Whitney U檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)分析。除Sham組外梗死各組小鼠均出現(xiàn)評(píng)分各異的左側(cè)肢體偏癱，神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高。藥物干預(yù)的SAs和SAB兩組神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于pMCAO組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SAs和SAB兩組比較神經(jīng)功能缺損無(wú)明顯差別。提示SAs能改善急性局灶性腦梗死小鼠的神經(jīng)功能缺失，其效果與SAB相當(dāng)。
　　2注射用丹參多酚酸能減輕

7、腦水腫。
　　Sham組梗死側(cè)腦組織水含量為79.67％±1.89％。pMCAO組小鼠梗死側(cè)腦組織含水量明顯升高至84.42％±2.87％(P＜0.05)。給予藥物干預(yù)后，SAs組和SAB組梗死側(cè)腦組織含水量降至82.49％±2.89％，81.81％±1.68％，與pMCAO組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。SAs和SAB兩組比較梗死側(cè)腦組織水含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示SAs能減少急性局灶性腦梗死小鼠腦水含

8、量，其效果與SAB相當(dāng)。
　　3注射用丹參多酚酸能降低腦梗死體積。
　　在pMCAO組出現(xiàn)蒼白色梗死區(qū)域。與pMCAO組相比，SAs組和SAB組病變側(cè)梗死體積明顯減小，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pMCAO vs.SAs，SAB:54.67％±3.14％ vs.42.88％±2.75％,37.88％±1.29％, P＜0.05)，而SAs組和SAB組患側(cè)梗死體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。提示SAs能降低急性局灶性腦梗死小鼠腦

9、梗死體積，其效果與SAB相當(dāng)。
　　4注射用丹參多酚酸能改善血腦屏障的通透性。
　　在pMCAO術(shù)后24 h，通過(guò)測(cè)量腦中伊文斯蘭的漏出量，來(lái)評(píng)價(jià)血腦屏障的通透性。藍(lán)色區(qū)域表示伊文斯蘭漏出，指示血腦屏障通透性增加。pMCAO組病變側(cè)腦組織血腦屏障通透性明顯增加(P＜0.05 vs.Sham組)。SAs組和SAB組病變側(cè)腦組織伊文斯蘭透過(guò)量均明顯低于pMCAO(P＜0.05)。SAs組和SAB組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示SA

10、s能降低急性局灶性腦梗死小鼠血腦屏障通透性，其效果與SAB相當(dāng)。
　　5注射用丹參多酚酸能增加機(jī)體抗氧化能力。
　　本實(shí)驗(yàn)中與Sham組相比，pMCAO組24 h后小鼠梗死側(cè)腦組織勻漿中總SOD和CU-Zn SOD的活性均明顯下降，而SAs組與SAB組可明顯提高兩種SOD活性，減低MDA的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。而SAs組與SAB組之間并無(wú)明顯差異，說(shuō)明SAs可以清除急性局灶性腦梗死后自由基的腦損傷，提高機(jī)體

11、抗氧化損傷的能力，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，其保護(hù)作用與SAB相當(dāng)。
　　6注射用丹參多酚酸對(duì)claudin-5，occludin，MMP-9，AQP-4蛋白表達(dá)量的影響。
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:腦梗死后24小時(shí)claudin-5和occludin蛋白表達(dá)降低，而MMP-9和AQP-4蛋白表達(dá)升高。藥物干預(yù)后claudin-5和occludin蛋白表達(dá)升高，MMP-9和AQP-4蛋白表達(dá)降低，SAs組與pMCA

12、O組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而SAs組與SAB組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:我們研究發(fā)現(xiàn)，注射用丹參多酚酸具有腦保護(hù)作用，能降低腦梗死小鼠神經(jīng)功能缺損，減輕腦水腫，減小腦梗死體積。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，注射用丹參多酚酸能夠減輕梗死后血腦屏障的通透性，下調(diào)腦組織MMP-9和AQP-4的表達(dá)量，上調(diào)claudin-5和occludin表達(dá)量，同時(shí)提高SOD活性并降低MDA含量。保護(hù)作用與陽(yáng)性對(duì)照物SAB相當(dāng)。我們推斷，注射