注射用丹參多酚酸對(duì)腦缺血大鼠VEGF、IL-10表達(dá)的影響.pdf

1、缺血性腦血管病是全球死亡率和長期致殘率的主要原因，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，已嚴(yán)重威脅到人類的生命和健康。缺血性腦卒中的發(fā)生過程中涉及多種病理生理學(xué)機(jī)制，包括氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞及微血管功能障礙，細(xì)胞壞死、凋亡等，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及微血管障礙是主要機(jī)制。在大腦血管阻塞后數(shù)分鐘，即可迅速啟動(dòng)一系列腦缺血生物化學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，炎性因子的釋放：腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)

2、，白介素-10(Interleukin-10，IL-10)，白介素-1(Interleukin-1，IL-1），白介素-20(Interleukin-20，IL-20)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)等因子。其中，白介素-10是主要的抗炎和神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過抑制多種促炎因子如TNF-α，IL-1β，IL-8的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用。血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）

3、是非常重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。在腦缺血損傷后VEGF水平上調(diào)已在動(dòng)物模型中證實(shí)。由于復(fù)雜的病理生理學(xué)機(jī)制，治療缺血性腦卒中已成為臨床工作的重點(diǎn)。近年來，關(guān)于中藥在急性腦缺血損傷的治療方面研究非常活躍，傳統(tǒng)經(jīng)典中藥丹參已廣泛應(yīng)用于臨床治療多種微循環(huán)障礙相關(guān)疾病，如：心血管疾病，腦血管疾病，腎臟功能障礙，肝纖維化及糖尿病并發(fā)癥等，具有多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)。
　　注射用丹參多酚酸（Salvianolatelyophilizedinjec

4、tion，SLI)）是丹參的水溶性提取物，具有多種藥理活性，主要由丹酚酸B(salvianolicacidB)、丹酚酸D、丹酚酸E、迷迭香酸等組成，已有研究證實(shí)丹參多酚酸可通過血腦屏障，降低大鼠腦組織缺血面積，清除自由基，抑制炎性細(xì)胞浸潤，改善循環(huán)等達(dá)到治療急性腦缺血目的。目前丹參多酚酸在急性腦缺血的抗炎及血管保護(hù)研究尚少見，本實(shí)驗(yàn)通過采用經(jīng)典的大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型（Middlecerebralarteryocclusion,MC

5、AO），給予注射用丹參多酚酸腹腔注射（30mg/Kg），并選取6h、12h、24h、48h四個(gè)不同缺血時(shí)間點(diǎn)，通過應(yīng)用Zea-Longa法評(píng)估注射用丹參多酚酸對(duì)急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損，TTC染色觀察注射用丹參多酚酸對(duì)MCAO大鼠腦梗塞體積影響,HE染色觀察缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA),蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測方法(WesternBlot),免疫組織化學(xué)檢測法檢測注射用丹參多酚酸對(duì)MCAO大鼠的血清及腦組

6、織中VEGF、IL-10表達(dá)水平的影響，以證實(shí)丹參多酚酸在急性腦缺血中發(fā)揮的抗炎及血管神經(jīng)保護(hù)作用。
　　材料與方法：
　　選取健康雄性SD大鼠（體重250-280g）120只，清潔級(jí)，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（MCAO組）、丹參多酚酸治療組（MCAO+SLI組），再按缺血時(shí)間隨機(jī)分為6h、12h、24h、48h4個(gè)亞組。采用改良Longa法制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型。Sham組

7、除了不結(jié)扎血管其余步驟同模型組，大鼠清醒后，在腦缺血不同時(shí)間點(diǎn)MCAO+SLI組腹腔注射丹參多酚酸30mg/Kg，MCAO組、Sham組給予等量的生理鹽水。分別于6h、12h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)對(duì)三組腦缺血大鼠采用Longa評(píng)分法評(píng)估大鼠神經(jīng)功能，1-3分入組，0分、4分剔除；TTC染色法評(píng)估腦缺血大鼠腦梗死程度，ELISA法檢測血清VEGF、IL-10水平，WesternBlot法檢測腦組織中VEGF、IL-10的含量，HE染色法觀

8、察缺血半暗區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化，免疫組織化學(xué)法檢測腦缺血大鼠腦組織中VEGF、IL-10的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、神經(jīng)行為評(píng)分及TTC染色結(jié)果
　　不同時(shí)間點(diǎn)，Sham組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分；MCAO+SLI組與MCAO組相比，腦缺血后6h、12h神經(jīng)功能評(píng)分無明顯差異（P>0.05），24h、48h神經(jīng)功能評(píng)分改善明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　腦缺血后24小時(shí)，MCAO組及MCAO+S

9、LI組大鼠TTC染色結(jié)果：左側(cè)大腦中動(dòng)脈支配區(qū)域均顯示白色，但MCAO+SLI組白色區(qū)域明顯較MCAO組縮小，對(duì)側(cè)大腦顯示紅色；Sham組大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈支配區(qū)顯示紅色，對(duì)側(cè)大腦顯示紅色。
　　2、ELISA法及WesternBlot檢測血清、腦組織VEGF、IL-10的表達(dá)
　　ELISA法檢測結(jié)果：在不同缺血時(shí)間點(diǎn)，Sham組血清VEGF、IL-10含量少，MCAO組與MCAO+SLI組含量均較Sham組高（P<0.0

10、5），MCAO+SLI組與MCAO組相比，血清VEGF、IL-10水平均升高（P<0.05）。
　　Westernblot法檢測結(jié)果：Sham組大鼠腦組織VEGF、IL-10僅少量表達(dá)，MCAO組、MCAO+SLI組VEGF、IL-10的表達(dá)6h時(shí)開始升高，24h達(dá)到高峰，48h稍有下降。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MCAO+SLI組與MCAO組比較明顯升高（P<0.05）。
　　3、HE染色及免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果
　　HE染色：S

11、ham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，胞核染色清晰，胞質(zhì)均勻。缺血后梗死灶周圍神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，胞核固縮，胞質(zhì)不均勻。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，可以看出MCAO組均較MCAO+SLI組壞死的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增多。
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：鏡下觀察大鼠左側(cè)皮層缺血半暗帶區(qū)，Sham組大鼠腦組織VEGF、IL-10僅少量表達(dá)，免疫陽性細(xì)胞數(shù)較少；MCAO組、MCAO+SLI組VEGF、IL-10的免疫陽性細(xì)胞數(shù)6h時(shí)開始升高，24h達(dá)到