抑制腸上皮細(xì)胞O型糖鏈的合成減少細(xì)菌的粘附及其MUC2表達(dá).pdf

1、研究背景和目的:
　　腸道在機(jī)體中是獨(dú)特的,從出生開始就被大量的微生物定植,尤其是細(xì)菌。粘液作為宿主-細(xì)菌相互作用的關(guān)鍵介質(zhì),是管腔微生物與底層的免疫細(xì)胞之間的重要屏障。腸道粘液主要成分是粘蛋白2( MUC2),粘蛋白家族的一個重要組成成員。小鼠缺乏 Muc2將導(dǎo)致結(jié)腸粘液層缺乏,但不會限制細(xì)菌附著到粘膜組織,這可能在小鼠的成長中導(dǎo)致嚴(yán)重的自發(fā)性結(jié)腸炎和結(jié)直腸癌。高分子質(zhì)量的O-連接糖蛋白作為粘蛋白的主要成分,廣泛表達(dá)于人體各個部

2、位,并在生理和病理過程中扮演著許多重要的角色。粘蛋白型O-glycans主要包含 Core1,Core2,Core3和Core4四種不同的類型。Core1 O-glycans是主要的 O-glycans,在大多數(shù)組織中表達(dá)。缺失 Core1 O-glycans嚴(yán)重?fù)p壞了小鼠腸道粘液層的形成,并誘發(fā)自發(fā)性腸道炎癥。但是O-glycans如何促進(jìn)粘液屏障的完整性,以及與腸道菌群相互作用維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)仍不清楚。本研究用芐基-N-乙酰基-

3、α-D-半乳糖胺(benzyl-α-GalNAc)來處理結(jié)腸癌上皮細(xì)胞 HT-29及其分化型細(xì)胞 HT-29-Gal,觀察腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli serotvpe O157:H7 or EHEC O157:H7)和腸致病性大腸桿菌(enterop athogenic Escherichia coli or EPEC)對腸上皮細(xì)胞粘附行為的改變;對HT-29細(xì)胞進(jìn)行Core1

4、合酶(C1GALT1)的RNA干擾,并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,為進(jìn)一步觀察Core1合酶抑制的腸上皮細(xì)胞與細(xì)菌的粘附創(chuàng)造必要的條件。通過研究粘蛋白分子上O-glycans與病原微生物之間的相互作用,幫助我們理解目前患病率日益增加的炎癥性腸病的發(fā)生機(jī)制。
　　方法:
　　1.將結(jié)腸癌上皮細(xì)胞HT-29進(jìn)行半乳糖誘導(dǎo),得到分化型細(xì)胞HT-29-Gal。
　　2.將HT-29和促分化型HT-29-Gal細(xì)胞用benzyl-α-

5、GalNAc處理,得到O型糖鏈合成抑制的命名為HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN的細(xì)胞。
　　3.采用 Western blot和 Real-time PCR方法檢測腸分化細(xì)胞 HT-29-Gal和benzyl-α-GalNAc處理得到的HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN細(xì)胞中MUC2的表達(dá)情況。
　　4.將HT-29,HT-29-Gal,HT-29-OBN和HT-29-Gal-OBN四種細(xì)胞分別與大

6、腸桿菌EHEC O157:H7和EPEC共培養(yǎng),采用系列稀釋菌落計數(shù)法和免疫熒光染色法觀察細(xì)菌在上述四種細(xì)胞表面的粘附情況。
　　5.構(gòu)建Core1合酶(C1GALT1)的干擾質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Core1合酶高表達(dá)的HT-29細(xì)胞,并進(jìn)行G418篩選。
　　結(jié)果:
　　1. Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示,相對于HT-29和HT-29-Gal細(xì)胞,經(jīng)benzyl-α-GalNAc處理后的 HT-2