膽汁內(nèi)外引流術(shù)對梗阻性黃疸大鼠腸黏膜MUC2蛋白表達的影響.pdf

1、近年來，大量科學(xué)研究證實腸黏膜屏障損傷是導(dǎo)致梗阻性黃疸(obstructive jaundice,OJ)菌血癥及內(nèi)毒素血癥的重要原因，并會引發(fā)全身炎癥反應(yīng)及多器官功能障礙危及生命。腸道黏液層(mucus layer)是宿主腸黏膜第一道天然防御屏障，它主要由腸道杯狀細胞合成和分泌的黏蛋白-2(mucin2,MUC2)組成，MUC2蛋白通過其N-端和C-端蛋白結(jié)構(gòu)域形成巨大網(wǎng)狀聚合物，構(gòu)成腸道黏液層骨架，在腸道黏液屏障中起到了至關(guān)重要的保護

2、作用。正常腸道黏液層中，MUC2蛋白能夠潤滑腸道，避免腸道有害物質(zhì)與腸上皮細胞直接接觸，同時還能發(fā)揮免疫屏障功能，抵御腸腔病原體的侵害。多項研究證實腸黏膜屏障損傷時，腸道黏液層變薄、破損，MUC2蛋白表達改變，導(dǎo)致腸上皮細胞被細菌侵襲，腸黏膜穩(wěn)態(tài)失衡，炎癥反應(yīng)加重，所以積極開展對OJ時腸道黏液層及MUC2蛋白的實驗性研究，具有重大臨床指導(dǎo)意義。
　　OJ是一類由于肝外或肝內(nèi)膽管梗阻，引起膽紅素升高，并出現(xiàn)組織及體液黃染等一系列臨床

3、表現(xiàn)的疾病，目前臨床上引起膽道梗阻疾病很多，但主要分為兩大類，一類是良性病變，包括膽總管或肝總管結(jié)石、膽管良性狹窄、膽腸吻合口狹窄；另一類是惡性疾病，包括肝門部膽管癌、壺腹周圍癌、胰頭癌；對于惡性O(shè)J病人，外科手術(shù)仍然是主要的治療方法，但對于外科手術(shù)前是否需要解除梗阻，目前仍有爭議，一方認為術(shù)前解除梗阻能有效降低術(shù)后發(fā)病率和死亡率；另一方認為解除梗阻的操作本身會引起并發(fā)癥，最終導(dǎo)致弊大于利；而且對于解除膽道梗阻的方式，是采用膽汁內(nèi)引流術(shù)

4、，還是膽汁外引流術(shù)，迄今仍有爭議；多數(shù)學(xué)者認為內(nèi)引流術(shù)更符合人體正常生理解剖，并恢復(fù)膽汁酸腸肝循環(huán)，能提供重要抑菌功能，改善腸黏膜屏障損傷和降低內(nèi)毒素相關(guān)并發(fā)癥。因此本實驗將進一步探討膽汁內(nèi)、外引流術(shù)對OJ大鼠腸黏膜MUC2蛋白表達的影響及意義。具體實驗內(nèi)容如下：
　　目的：探討膽汁內(nèi)、外引流術(shù)對OJ大鼠腸黏膜MUC2蛋白表達的影響及意義。
　　方法:雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體重約200-250g，隨機分

5、成假手術(shù)組(sham operation,SH)，梗阻性黃疸組(obstructive jaundice,OJ)，膽汁內(nèi)引流組(internal drainage,ID)和膽汁外引流組(external drainage,ED)組。
　　1.手術(shù)造模過程
　　第一次手術(shù)：
　?、賁H組：開腹后只做十二指腸牽拉，不結(jié)扎膽管；
　?、贠J組：開腹后首先找到肝臟及十二指腸，在肝臟與十二指腸間找到膽總管（與肝門靜脈伴行）

6、，雙重結(jié)扎膽總管，中間離斷；
　?、跧D組：操作同OJ組；
　?、蹺D組：操作同OJ組；
　　7天后行第二次手術(shù)：
　　①SH組：再次開腹后，只做十二指腸牽拉，不做其他處理；
　?、贠J組：開腹后可見膨大膽管，只做十二指腸牽拉，不做其他處理；
　?、跧D組：開腹后可見膨大的膽管，引流管一端插入膽管，縫線固定，
　　另一端與十二指腸相通，荷包縫合固定；
　?、蹺D組：開腹后可見膨大的膽管，引

7、流管一端插入膽管，縫線固定，另一端經(jīng)皮下引致頸背部縫線固定；
　　2.標(biāo)本留?。?br>　　4組大鼠模型均于2次術(shù)后7天取材，留取下腔靜脈血2ml用于檢驗內(nèi)毒素及肝功能，取距回盲瓣約10cm的小腸數(shù)段，常規(guī)HE染色觀察腸黏膜病理形態(tài)學(xué)變化；電鏡下觀察腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及杯狀細胞合成、分泌情況；阿爾辛藍-過碘酸雪夫氏(alcian blue/perioodic acid Schiff,AB/PAS)染色觀察陽性染色杯狀細胞的分泌及黏液層

8、厚度的改變情況；應(yīng)用免疫組化染色法（Immunohistochemistry,IHC）測定MUC2蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.動物一般狀態(tài)大體觀察:OJ，ID，ED組大鼠第一次手術(shù)行膽總管結(jié)扎后進食進水減少，耳部皮膚發(fā)黃，尿色變黃，運動減少；ED與ID組大鼠第二次手術(shù)解除梗阻后進食進水增多，活動增加，尿色逐漸變清亮、透明；OJ組2次手術(shù)后（只牽拉十二指腸），皮膚毛色及尿液較前無明顯變化，進食進水及活動進一步減少，精神萎

9、靡，體重減輕；SH組一般情況穩(wěn)定，未見明顯異常。
　　2.肝功能及內(nèi)毒素：OJ組(0.93±0.28EU/ml)大鼠血清內(nèi)毒素水平明顯高于SH組(0.15±0.10EU/ml)(p<0.01)；ID組(0.21±0.12EU/ml)和ED組(0.44±0.20EU/ml)血清內(nèi)毒素水平較OJ組(0.93±0.28EU/ml)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，且ID組較ED組血清內(nèi)毒素水平降低更明顯，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義

10、(p<0.05)；OJ組TBIL(107.72±18.22μmol/L)、ALT(122.82±36.23U/L)、AST(409.48±73.06U/L)較SH組(21.46±3.45μmol/L)、(40.79±9.24U/L)、(88.72±29.31U/L)均顯著升高(p<0.01)；ID組血清TBIL(30.51±12.44μmol/L)、ALT(56.79±19.66U/L)、AST(178.49±67.52U/L)和 ED

11、組血清TBIL(35.89±15.57μmol/L)、ALT(59.44±20.11U/L)、AST(109.09±38.06U/L)較OJ組均明顯降低(p<0.01)；ID組與ED組大鼠血清TBIL、ALT值無顯著性差異(p>0.05)，ED組血清AST較ID組下降更明顯(p<0.05)。
　　3.HE染色示：SH組腸黏膜黏膜上皮完整，黏膜腺體及絨毛排列整齊，黏膜、黏膜下層及肌層等各層次清晰，伴少許炎性細胞浸潤；OJ組大鼠腸黏膜

12、完整性破壞，腺體排列紊亂，腸絨毛短縮，變鈍，間隙增大，固有層大量炎性細胞浸潤，OJ組chiu腸黏膜損傷評分(3.93±1.10)較SH組(0.28±0.40)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)；OJ組腸絨毛高度(175.14±65.38μm)較SH組(457.67±88.56μm)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。ID組與ED組大鼠腸黏膜形態(tài)較OJ組明顯改善，ID組與ED組chiu腸黏膜損傷評分均明顯低于OJ組(1.6

13、4±0.94)，(2.81±0.75)，(3.93±1.10)(p<0.01)，ED組chiu腸黏膜損傷評分高于ID組(p<0.05)，ID組和ED組腸絨毛高度(324.85±65.84μm)，(291.63±66.36μm)相近(p=0.37)，但兩組均明顯高于 OJ組(175.14±65.38μm)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。
　　4.AB-PAS染色示：SH組杯狀細胞胞內(nèi)充滿紫紅色物質(zhì)，AB-PAS染色的平均光密度值

14、(OD0.43±0.06)，腸道黏液層形態(tài)完整，厚度(316.5±52.32μm)；OJ組大鼠腸杯狀細胞胞內(nèi)被染成紫紅色物質(zhì)減少，黏液層變薄，破損，甚至缺失，OJ組AB-PAS染色的平均光密度值(OD0.16±0.05)低于SH組(OD0.43±0.06)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)；OJ組黏液層厚度(77.14±38.66μm)明顯低于SH組(316.50±52.32μm)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)；ID組較OJ組大鼠A

15、B-PAS染色的平均光密度值明顯增多(OD0.35±0.05)，(OD0.16±0.05)(p<0.01)，ID組腸道黏液層厚度(257.47±80.57μm)較 OJ組(77.14±38.66μm)明顯增加(p<0.01)；ED組較OJ組AB-PAS染色的平均光密度值(OD0.26±0.04)，(OD0.16±0.05)增高，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；ED組黏液層厚度(137.38±38.15μm)高于OJ組(77.1

16、4±38.66μm)(p<0.05)；ID組OD值高于ED組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，ID組黏液層厚度高于ED組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。
　　5.電鏡下可見：SH組腸黏膜微絨毛排列整齊，杯狀細胞內(nèi)黏液顆粒飽滿。OJ組大鼠，腸黏膜微絨毛明顯稀疏、部分斷裂，排列紊亂，部分杯狀細胞黏液顆粒稀少，出現(xiàn)空泡，ID組與ED組大鼠腸黏膜微絨毛整齊，可見杯狀細胞充滿粘液顆粒；胞內(nèi)黏液顆粒較OJ組增多。
　　6.免疫組化

17、示：SH組大鼠腸黏膜MUC2蛋白被染成棕褐色，主要表達于腸絨毛杯狀細胞以及絨毛表面，SH組MUC2蛋白表達平均光密度值值(OD0.46±0.03)；OJ組腸絨毛被染成棕褐色杯狀細胞稀少，腸絨毛表面棕褐色物質(zhì)明顯減少，MUC2蛋白表達平均光密度值(OD0.16±0.02)較SH組(OD0.46±0.03)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)；ID組(OD0.39±0.03)與ED組(OD0.33±0.03)腸黏膜MUC2蛋白表達平均